CRISP1在性腺中的定位和表達及其生殖調節功能的研究進展

黃小烜，羅金，穆楊，徐望明

(武漢大學人民醫院生殖醫學中心，武漢 430060)

哺乳動物精子在進入雌性生殖道后，需要經歷獲能、頂體反應、精卵質膜融合等一系列事件才能使卵子受精，隨著基因敲除技術的發展，已經發現了許多在受精過程中起到關鍵作用的分子，其中就包括富含半胱氨酸分泌蛋白1(cysteine-rich secretory protein 1，CRISP1)[1]。有大量的體外實驗和基因敲除模型研究顯示，附睪內的CRISP1參與了精子獲能、精子-透明帶結合及精卵融合的調控[2-4]。基于以上研究結果，CRISP1被認為是目前在避孕干預中一個具有前景的靶點，有望在此基礎上開發出安全有效且可逆的男性避孕疫苗[5]。本文就CRISP1在不同物種性腺中的定位、表達研究成果及其在精子獲能、精子-透明帶結合及精卵融合等生殖調節中的作用進行綜述。

一、CRISP1的表達及定位

Cameo等[6]最早在1976年通過聚丙烯酰胺凝膠電泳發現了僅由大鼠附睪分泌的蛋白CRISP1，這種蛋白有兩種形式，被分別稱為D蛋白和E蛋白，其由附睪頭部近端的上皮細胞以雄激素濃度依賴性方式合成，并分泌到附睪管腔中[7]。人CRISP1由Hayashi等[8]于1996年發現，與嚙齒動物CRISP1有一定的相似性。目前對CRISP1的研究大部分仍集中于嚙齒動物，而對人CRISP1探索較少。

精子在附睪成熟的過程中，CRISP1與精子表面結合，在精子進入雌性生殖道后發揮作用[7]。在對大鼠的研究中，CRISP1最初定位于精子頭部頂體區域，隨著頂體反應的發生，兩種形式的蛋白定位會發生改變：分子量較大的D蛋白以松散、可逆的方式結合在精子表面，當精子離開附睪進入雌性生殖道后，D蛋白會從精子表面釋放；而分子量較小的E蛋白同精子表面緊密結合，隨著頂體反應的發生E蛋白仍結合在精子表面，并遷移到精子頭部的赤道板區域[9]。CRISP1與精子結合的機制仍然未知，但有研究顯示Zn2+能與CRISP1形成CRISP1-Zn2+復合物并參與CRISP1與精子在附睪成熟過程中的松散結合，而CRISP1與精子的緊密結合機制被認為可能與附睪小體有關[7]。但CRISP1與精子結合的機制還有待進一步研究。

隨著對CRISP1研究的深入，可以發現，CRISP1的表達及定位在不同物種之間有差異。對絨山羊CRISP1在睪丸和頂體反應前后的精子表面定位的研究中，研究者發現CRISP1在絨山羊睪丸組織中廣泛表達，但主要集中在生精小管內側中央區，晚期精子細胞富集區域；CRISP1在精子表面的定位也隨著頂體反應的發生而改變，但頂體反應前CRISP1主要定位于精子尾部與頭部的連接處，頂體反應后CRISP1主要定位于精子頭部的赤道板區域[10]。對于CRISP1在人性腺組織中的表達及定位，各項研究結果并不一致，有研究顯示人CRISP1只在附睪分泌[11]，而另一個研究顯示在人類輸精管和精囊中也有CRISP1基因的表達[12]。另外，與大鼠CRISP1僅由附睪頭部近端的上皮細胞分泌不同，Leir等[13]對成人附睪上皮細胞以附睪頭部、體部和尾部分段進行了原代培養，經檢測后發現，附睪頭部、體部和尾部均有CRISP1的表達，且各部分表達量相當。

二、CRISP1的功能

CRISP家族蛋白有三個潛在功能結構域：N末端的PR結構域、C末端的ICR結構域和鉸鏈區結構域，ICR結構域和鉸鏈區結構域也被合稱為CRD結構域[14]。PR結構域可能介導CRISP1參與精卵融合，CRD結構域可能介導CRISP1的抑制獲能功能[15]。

1.調節精子獲能：精子獲能是哺乳動物受精的重要步驟，而酪氨酸磷酸化是獲能最重要的過程之一[16]。有研究顯示，在大鼠中CRISP1以濃度依賴性方式抑制酪氨酸磷酸化，從而抑制精子獲能，這種抑制作用是可逆的，可以通過外源性cAMP來克服，表明CRISP1等可能通過控制精子質膜表面的某些離子通道，在獲能早期產生抑制作用[17]。有研究顯示，CRISP1以濃度依賴性方式瞬時結合于精子表面，在與其抑制獲能活性一致的濃度范圍內，這種結合是飽和的[18]，這也證實了CRISP1抑制精子獲能的濃度依賴性。Da等[19]對小鼠進行CRISP1基因敲除，顯示獲能期間在突變體精子中酪氨酸磷酸化水平明顯低于對照組。而最近Hu等[20]對小鼠進行基因敲除后，結果顯示僅CRISP1缺陷并沒有改變獲能精子的百分比及酪氨酸磷酸化水平。有研究者認為產生這種差異的原因可能是實驗小鼠遺傳背景不同導致了生殖表型不同[21]。CRISP1對精子獲能產生的影響可能還需要進一步的驗證。

2.參與精卵間相互作用：對CRISP1基因敲除小鼠進行體外受精的檢測中，突變體精子穿過透明帶完整或無透明帶的卵子的能力顯著降低，表明在缺乏CRISP1的情況下，精子穿過透明帶和與卵融合的能力降低[19-20]。在大鼠中，如前述，兩種形式的CRISP1，E蛋白與D蛋白的作用機制不同，E蛋白會隨著頂體反應的發生，定位到精子頭部的精卵融合區域上，參與精卵融合[2]。CD9是已知的卵細胞膜上介導精卵融合的精子結合位點[22-23]，有研究顯示在靈長類動物中，CRISP1能與CD9相互作用，促進精卵融合，但具體作用機制仍不明確[24]。此外，CRISP1也參與了精子與透明帶的結合，且作用在結合的初始階段[7]。CRISP1參與精卵間相互作用的過程可以概括為：位于精子頂體區域的CRISP1與透明帶結合，誘導精子發生頂體反應，緊密結合于精子表面的CRISP1(E蛋白)遷移到精子頭部的赤道板區域，通過與卵子表面的精子受體結合，啟動精卵融合。

對人CRISP1功能的研究顯示，將人精子與抗CRISP1抗體共同孵育一段時間后，人精子穿透倉鼠卵子的能力顯著降低，并呈現濃度依賴性，而抗CRISP1抗體對人精子的活力、頂體反應的發生及精子與倉鼠卵的結合并無顯著影響，CRISP1可能通過與人卵子表面的特異性CRISP1結合位點結合參與精卵融合[4]。有研究顯示，CRISP1能通過與人類重組蛋白ZP3以濃度依賴性方式相互作用參與到精子-透明帶結合的起始階段[25]，ZP3是透明帶上與人精子結合的最主要位點[26]，因此，同嚙齒動物一樣，CRISP1既參與了精卵融合，也參與了精子-透明帶結合。CRISP1在人受精過程中的這些功能被認為是與精子緊密結合的CRISP1部分的功能[27]，而與精子松散結合可溶于精漿的CRISP1在精液中的作用仍有待確定。

3.調節精子的運動及方向：近年來有對基因敲除小鼠的研究顯示CRISP1也存在于雌性配子中，由卵丘細胞表達，并可以通過抑制精子的過度活化和增強精子的線性泳動來調節精子的運動及方向[28]。最新的研究顯示，CRISP1基因敲除小鼠的精子運動速度會下降[20]。

4.可作為無精子癥的診斷標志物：有研究發現，梗阻性無精子癥患者精液中CRISP1水平顯著低于非梗阻性無精子癥患者精液和正常精液中CRISP1水平，研究者認為男性生殖道任何部位的梗阻都可能導致精液中CRISP1水平的降低，因此CRISP1對于區分梗阻性和非梗阻性無精子癥有相當大的診斷能力，可作為不同類型無精子癥的診斷標志物[29]。

三、CRISP1作為避孕的靶點

目前國內外對于CRISP1的研究，在動物試驗中主要研究了CRISP1的表達定位及其在受精過程中的作用，結果表明CRISP1滿足作為避孕靶點的許多必要條件：①它是附睪特異性蛋白；②影響生育力；③它在精子獲能及精卵融合中起特定作用；④它的活性位點已被鑒定；⑤人類生殖道也具有同源的CRISP1[30]。有研究顯示，用天然或重組大鼠CRISP1對動物進行免疫，在超過90%的動物中產生了針對CRISP1的特異性抗體，并且這種抗體對動物生育力的抑制作用是可逆的[7]。本課題組前期構建的pcDNA-mCRISP1 DNA疫苗，使免疫后的雌/雄性小鼠均產生了特異性的抗體，并誘導一定的抗生育反應[31-32]。進一步的研究表明，免疫產生的小鼠CRISP1特異性抗體對正常雄性小鼠附睪精子的活動力和存活率、自發或誘發頂體反應發生率無顯著影響，也不會引起精子的凝集反應及影響精卵黏附，但當抗體濃度達到一定水平時，受精率會顯著下降，也說明小鼠CRISP1抗體特異性地作用于精卵融合階段，導致生育力的下降[17]。然而，與其他研究中的發現一樣，CRISP1缺陷并不能導致男性完全不育[33]，mCRISP1 DNA疫苗僅能使免疫小鼠生育力下降40%～50%[31]。為了增強疫苗效果，在后續研究中，我們使用了殼聚糖-DNA納米顆粒作為載體，顯著提高了mCRISP1 DNA避孕疫苗的免疫效應[34-35]，雖然小鼠的生育力仍然沒有被完全阻斷，但為進一步開發出高效、安全、經濟的避孕疫苗奠定了基礎。

四、結語

綜上，在動物研究中已經確定CRISP1參與了受精過程中的多個環節，但其中的機制仍有待進一步探索。近年的研究顯示了CRISP1也對精子的運動及方向有調節作用，并提出雌性配子中也存在CRISP1。不僅不同物種之間CRISP1的表達及定位有差異，人體中CRISP1是否是僅由附睪特異性表達也無定論。因此，我們還需要對CRISP1的表達定位方面進行全面的研究。此外，目前對人CRISP1功能的研究尚少且有爭議，增加對人CRISP1功能方面的研究是有意義的。以CRISP1為靶點的避孕疫苗安全且可逆，是我們以后研究的重點。因此，CRISP1對生育力的影響及作用機制值得我們進一步深入研究。