預適應聯合后適應對大鼠缺血再灌注損傷的影響*

張濤 許文勝 郝冬梅 何宏偉 單新亮 李鑫瑤 孫旭 高彩鳳

(包頭醫學院基礎醫學與法醫學院免疫學教研室，內蒙古 包頭 014040)

腦缺血再灌注損傷主要是指恢復缺血腦組織的血流灌注對腦組織造成的嚴重損傷，其可引起一系列的細胞和生理反應，如產生大量氧自由基等活性分子、誘導前列腺素合成、誘導活化信號分子和誘導炎癥因子產生等，導致線粒體功能障礙，嚴重影響患者的生活質量[1-2]。而缺血預適應主要是指短暫缺血再灌注可增強腦組織對隨后較長時間缺血損傷的耐受性現象，缺血后適應主要是指在腦缺血后再灌注早期采用反復數次短暫缺血再灌注可保護腦組織以防止再灌注損傷，二者均可調動細胞內源性保護機制，進而抵抗神經細胞損傷，但具體作用機制目前尚不完全清楚[3-4]。為了進一步討論預適應聯合后適應對大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護作用，本研究將SD大鼠制作腦缺血/再灌注損傷模型后的神經功能、腦梗死灶體檢、腦組織氧化應激損傷生化指標及神經元凋亡情況進行了檢測分析，并與正常大鼠進行了比較，旨在為臨床提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 選取清潔級雄性SD大鼠50只，體質量240～300g，由內蒙古科技大學包頭醫學院動物中心提供，合格證號：201407413，ddY系SPF級。將大鼠隨機分為5組，每組各10只：假手術組(僅分離大鼠頸部血管，不插線栓)、模型組(線栓法行大腦中動脈阻閉120min后再灌注)、預適應組(在造模前24h和1h行3個循環的缺血15s+再灌注30s)、后適應組(在造模后行3個循環的再灌注30s+缺血15s)和預適應+后適應組(在造模前24h和1h行3個循環的缺血15s+再灌注30s以及在造模后行3個循環的再灌注30s+缺血15s)。

1.2 儀器與試劑 精密電子天平(DV215CD)購自日本奧豪斯公司；高速離心機(CRII)購自日本日立公司；數碼相機(A-550)購自日本SONY公司，彩色病理圖文分析系統(HPIAS-1000)購自武漢千屏影像公司，紫外分光光度計(UV-2550)購自日本島津儀器公司，顯微鏡(Ls-210)購自日本奧林巴斯公司。丙二醛(MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒和考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒購自北京中金杉生物技術有限公司；TUNEL試劑盒購自德國Roche公司；氯化三苯基四氮唑(TTC)購自美國Sigma公司。

1.3 模型制備 所有實驗大鼠在術前均禁食12h，自由飲水，隨后行大腦中動脈阻閉120min后再灌注造成局灶性腦缺血再灌注損傷模型，具體造模方法如下：腹腔注射10%水合氯醛麻醉后頸部備皮、消毒，在頸正中做長約1.5 cm切口，分離右側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈，結扎頸外動脈遠心端及頸內動脈的顱外分支翼腭突動脈。利用動脈夾夾閉頸總動脈近心端和頸內動脈遠心端，防止血液返流，隨后在頸外動脈近分叉處剪一切口，經頸外動脈將線栓插入頸內動脈，松開頸內動脈遠心端的動脈夾后繼續插入線栓，直至到達大腦前動脈近端壁，阻斷大腦中動脈來自頸內動脈、大腦前動脈及大腦后動脈的所有血供。去除頸總動脈上的動脈夾，依次縫合肌肉和皮膚切口，但將線栓外留。阻斷120min后再次麻醉動物，將線栓緩慢拔出，恢復血流再灌注。假手術組僅分離頸內動脈和頸外動脈，不插線栓。

1.4 預適應與后適應處理 預適應方法：預適應組大鼠和預適應+后適應組大鼠在造模前24h和1h分別行3個循環的大腦中動脈缺血15 s+再灌注30 s作為預適應，即阻斷大腦中動脈15s后拔出線栓再灌注30s，重復3個循環。后適應方法：后適應組和預適應+后適應組大鼠在造模后拔出線栓再灌注30s，然后將線栓再次插入頸內動脈阻閉大腦中動脈15s，重復3個循環后進行持續再灌注48h。

1.5 腦梗死灶測定 各組于造模48h后隨機取4只處死后斷頭取腦，除去嗅球、小腦和低位腦干部分后切成約2 mm厚腦片，迅速放入氯化三苯基四氮唑溶液(TTC)中37℃染色30min，正常組織可被TTC染為深紅色，而缺血壞死的腦組織不與TTC反應，應為白色。將切片多聚甲醛固定后放置比例尺并拍照，利用圖像處理軟件描繪出每一層面染色成白色的區域后，按比例求出各腦片的梗死面積(紅色區域為正常腦組織，白色區域為梗死區)。

1.6 腦組織勻漿生化指標測定 各組再隨機取4只大鼠斷頭后取腦，去除小腦和嗅球后用冷生理鹽水漂洗，濾紙拭干后稱重，隨后加入等體積預冷的生理鹽水后利用勻漿機制成勻漿，高速離心機以6000r/min離心15min后取上清液，于冰箱保存待測。取少量上清液分別加入考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒、SOD試劑盒和MDA試劑盒進行處理，并利用紫外分光光度計分別在590nm、550nm和532nm處測定吸光度，根據公式求出樣本中蛋白質濃度、SOD活性和脂質過氧化產物MDA的含量，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.7 細胞凋亡測定 將各組剩余大鼠麻醉后先經心臟灌注生理鹽水，把血液沖凈后再用4%多聚甲醛灌注，隨后斷頭取腦，將缺血側腦組織用4%多聚甲醛固定。常規脫水和石蠟包埋處理，在視交叉后1mm處及4mm處行冠狀切片后做連續切片，厚約5μm。將相鄰大腦切片用TUNEL試劑盒進行染色后于顯微鏡下觀察并記錄實驗結果。陽性細胞結果應為棕黃色(核)或棕褐色，背景呈藍紫色，每張切片在普通光鏡下隨機釆集5個不重疊視野進行觀察，記錄每個視野中的凋亡細胞個數，取平均值作為凋亡細胞數。

1.8 神經功能缺陷評分 采用Longa等描述的5級神經缺陷評分法對大鼠手術后再灌注6、12、24和48h神經功能進行評分：0級為無神經功能缺陷，記為0分；Ⅰ級為不能完全伸展缺血病灶對側前肢，記為1分；Ⅱ級為行走時向缺血病灶對側轉圈，記為2分；Ⅲ級為行走時向缺血病灶對側傾倒，記為3分；Ⅳ級為不能自發行走，昏迷，記為4分。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分比較 再灌注后6h各處理組與模型組神經功能缺陷評分差異無統計學意義(P<0.05)；再灌注12、24和48h模型組神經功能缺陷評分明顯高于其他處理組(P<0.05)；再灌注12、24和48h處理組中，預適應+后適應組神經功能缺陷評分最低(P<0.05)，而預適應組和后適應組神經功能缺失評分比較差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 各組大鼠神經功能缺陷評分比較分)Table 1 Comparison of neurological function defects in each group

注：與模型組比較，①P<0.05；與預適應組比較,②P<0.05；與后適應組比較，③P<0.05

2.2 各組大鼠腦梗死灶體積比較 預適應+后適應組腦梗死灶體積為(100.41±33.26)mm3，明顯低于模型組、預適應組和后適應組(均P<0.05)；預適應組和后適應組腦梗死灶體積較模型組降低(P<0.05)；預適應組和后適應組腦梗死灶體積比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠腦梗死灶體積比較Table 2 Comparison of volume of cerebral infarction in rats

注：與模型組比較，①P<0.05；與預適應組比較，②P<0.05；與后適應組比較，③P<0.05

2.3 各組大鼠腦組織SOD和MDA比較 假手術組SOD活性明顯高于模型組，而MDA低于模型組(P<0.05)；模型組與預適應組SOD和MDA比較差異無統計學意義(P>0.05)；后適應組和預適應+后適應組SOD活性較模型組升高，而MDA較模型組降低(P<0.05)，見表3。

Table3SODactivityandMDAofratbraintissueineachgroup

組別SOD(μn/mgprot)MDA(nmol/mgprot)假手術組122 41±24 61①②③43 51±9 64①②③模型組45 56±10 31113 43±21 07預適應組48 63±11 07110 53±25 66后適應組76 81±9 83①②78 60±13 27①②預適應+后適應組110 13±12 16①②③④61 51±12 15①②③④ F84 63291 062 P<0 05<0 05

注：與模型組比較，①P<0.05；與預適應組比較，②P<0.05；與后適應組比較，③P<0.05；與假手術組比較，④P<0.05

2.4 各組大鼠皮質神經元凋亡影響 假手術組細胞凋亡數明顯低于模型組(P<0.05)；各處理組細胞凋亡數較模型組有所降低(P<0.05)，其中預適應+后適應組神經元細胞凋亡數最少，為(47.20±9.21)個，見表4、圖1。

表4 各組大鼠皮質神經元細胞凋亡比較Table 4 Comparison of apoptosis of cortical neurons in each group

注：與模型組比較，①P<0.05；與預適應組比較，②P<0.05；與后適應組比較，③P<0.05；與假手術組比較，④P<0.05

3 討論

缺血、低氧(I/HPC)指機體預先受一次或多次短暫、非致死性缺血/低氧刺激,再恢復常態后而獲得的更嚴重甚至致死性缺血或缺氧，是臨床醫學的常過程和基本病理死因，如CO中毒、缺血性腦病(肺性腦病、高血壓腦病、肝性腦病等)、帕金森氏病、新生兒窒息后由缺血缺氧引起的腦病，病情危重且病死率較高，甚至可以產生諸如智力低下、腦癱、癲痛、痙攣以及共濟失調等[5]，也是航天、高原、深水等極端環境所面臨的基本問題。

圖1 各組大鼠缺血側皮質TUNEL染色結果(×400)Figure 1 Results of TUNEL staining of ischemic lateral cortex in rats

缺血、低氧可導致機體免疫功能紊亂,誘發一些免疫炎癥性疾病,并可導致細胞和組織由于能量供給不足等一系列問題而出現炎癥、損傷，甚至死亡，而腦是人體對缺血最為敏感的器官，腦組織缺血將會導致局部腦組織及其功能的損害，即使短暫的缺血也可導致神經元的損傷或死亡，而長時間的完全缺血或嚴重缺血會引起梗死[6]。缺血后血流恢復無疑是維持和防止腦組織進一步損傷的必需措施,但再灌注后往往發生復雜的腦循環機能和代謝的變化,加重缺血后的腦組織損傷,常表現于圍術期腦外傷及頭頸部大血管手術[7]。Murry等[8]1986年發現，I/HPC后阻斷犬冠狀動脈40min所致的心肌梗死范圍比對照組減少75%，由此首次提出I/HPC的神經保護作用，并于1990年發現類似狀況[9]。I/HPC被認為是細胞內源性防護機制的啟動[9]，如促紅細胞生成素(EPO)血管內皮生長因子(VEGF)等[10-11]均在中樞神經系統中廣泛表達，機體抗缺氧或缺血可以促進二者表達增加，通過與配體結合，啟動內源性保護機制，依次激活一系列信號轉導通路及多種可能的機制發揮神經保護作用，減輕低氧/缺血引起的神經元損傷。這種防護機制一般通過預先給機體一個溫和的(亞致死性)缺血/低氧刺激。這一細胞內源性保護現象在大腦、腎臟、小腸和肝臟等器官都存在，腦缺血時腦細胞生物電會發生改變，并出現病理性慢波，缺血一定時間后再灌注，慢波持續并加重，而顳葉組織內神經遞質性氨基酸代謝也會發生明顯變化，即興奮性氨基酸隨缺血-再灌注時間延長而逐漸降低，抑制性氨基酸在缺血-再灌注早期明顯升高。缺血再灌注損傷時間越長，興奮性遞質含量越低，腦組織超微結構改變越明顯，但其具體機制目前尚不完全清楚[12-13]。

腦缺血再灌注損傷的機制目前己有多種學說,如自由基(ROS)學說、興奮性氨基酸毒性學說、韓超載學說、水通道學說、蛋白質合成抑制學說及基因遺傳學說等，其中ROS引發的脂質過氧化反應被認為是腦缺血/再灌注損傷的最為重要機制之一,其介導的連鎖反應是腦缺血/再灌注的核心病理生理過程[14-15]。ROS生成增多與黃嘌呤氧化酶形成增多、中性粒細胞的呼吸爆發、線粒體功能受損、兒茶酚胺自身氧化增加，而急劇增加的ROS可與細胞膜不飽和脂肪酸發生反應,形成脂質過氧化并導致細胞損傷破裂、血腦屏障破壞以及腦水腫形成[16]。ROS還可以攻擊細胞膜,造成細胞膜和線粒體損傷,最終導致細胞膜破壞及神經元損傷,并誘導細胞凋亡[17]。而細胞膜受損會加重血管源性腦水腫及缺血性腦損傷,并使大腦缺血半暗區出現血管痙攣與內凝血,從而導致腦梗死范圍擴大[18]。有研究表明，缺血預適應和缺血后適應均對腦缺血/再灌注損傷具有一定的保護作用[19]，但其具體機制目前尚不完全清楚。

本研究對SD大鼠腦缺血/再灌注損傷模型的神經功能、腦梗死灶體積、腦組織氧化應激損傷生化指標及神經元凋亡情況進行檢測分析，并與正常大鼠進行比較，結果表明，再灌注12、24和48h模型組神經功能缺陷評分明顯高于其他處理組，再灌注12、24和48h處理組中，預適應+后適應組神經功能缺陷評分最低，而預適應組和后適應組神經功能缺失評分比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示預適應+后適應可明顯改善腦缺血/再灌注損傷導致的神經功能下降程度，且比單獨預適應或后適應的效果更好。同時發現，假手術組SOD活性明顯高于模型組，而MDA低于模型組；模型組與預適應組SOD和MDA比較差異無統計學意義(P>0.05)；后適應組和預適應+后適應組SOD活性較模型組升高，而MDA較模型組降低。SOD可清除超氧陰離子,其活性的下降則意味著機體抗氧化能力的降低；而MDA的含量變化可間接反映腦組織中ROS含量的變化和腦組織的損傷程度，而后適應可明顯上調SOD水平并降低MDA水平，進而抑制ROS的爆發，其抗氧化作用較強。研究還發現，各處理組細胞凋亡數較模型組有所降低，其中預適應+后適應組神經元細胞凋亡數最少，而預適應+后適應組腦梗死灶體積明顯低于模型組、預適應組和后適應組，預適應組和后適應組腦梗死灶體積較模型組也明顯降低，提示預適應和后適應均可明顯改善腦組織的損傷程度，從而抑制再灌注期的氧化應激損傷,進而減少神經細胞的凋亡與壞死，且聯合后的保護效果更好。但本研究限于樣本量不足，對預適應聯合后適應對大鼠腦缺血再灌注損傷保護作用的具體機制仍需做進一步研究。

4 結論

預適應和后適應均能對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用，而兩者聯合應用能進一步加強保護作用。

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