B類1型清道夫受體基因敲除雌鼠不孕相關機制的研究進展

張劉洋，龔婷，喻紅，張元珍*

(1.武漢大學中南醫院生殖醫學中心，武漢 430071；2.海南省第三人民醫院婦產科，三亞 572099；3.武漢大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系，武漢 430071)

WHO一項調查結果顯示，截止2010年底，發展中國家平均每4個家庭中就有1對夫婦受到女性不孕的困擾[1]。女性不孕的主要病因包括卵巢功能障礙、輸卵管異常、子宮異常及不明原因的不孕等。其中，不明原因的不孕約占10～20%[2]，目前應用的檢測手段無法對其進行確診，且缺乏肯定有效的治療方法和療效指標，不明原因的不孕是女性不孕中仍待攻克的一大難題。另一方面，隨著生活水平的提高，不健康的生活方式所導致的肥胖、高脂血癥等疾病已成為人群中的常見病，脂代謝異常與不孕之間的關系也逐漸被人們所發現和重視。

B類1型清道夫受體(scavenger receptor class B type I，SR-B1)是首個被明確的高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)受體[3]，SR-B1基因敲除(SR-B1 gene knockout，SR-B1-/-)小鼠除HDL及膽固醇代謝紊亂、動脈粥樣硬化易感等特點外，還表現為雌性不孕。與此同時，大量流行病學研究顯示，人類SR-B1基因(SCARB1)單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)與血脂水平、冠心病易感性等有顯著相關性[4-5]，且SCARB1 rs4238001 SNP(G2S 突變)與卵泡液中孕酮水平下降及胚胎移植存活率顯著降低有關，rs10846744 SNP也顯示與胚胎存活率較低有關[6]。

多項研究證實，SR-B1-/-雌鼠體內異常的脂蛋白代謝與其不孕有密切的關聯，但其具體機制尚未明確。本文將從SR-B1的功能特點及SR-B1-/-雌鼠的病理改變出發，對其不孕的可能相關機制進行探究和分析。

一、SR-B1的基本功能

1.SR-B1參與細胞對脂蛋白膽固醇的攝取：SR-B1能以高親和力結合HDL而選擇性介導膽固醇攝取，它主要分布在肝臟、類固醇激素生成器官等組織細胞膜表面，參與膽固醇逆向轉運(reverse cholesterol transport，RCT)及類固醇合成細胞的膽固醇攝取等過程。

RCT的最終環節中，肝細胞表面的SR-B1可與攜有肝外組織膽固醇的HDL顆粒結合，HDL中膽固醇酯(cholesteryl ester，CE)被肝細胞選擇性攝取進入胞內，隨之被代謝為膽汁而排出體外[7]。此外，肝細胞表面的SR-B1還可介導細胞對HDL中脂質氫過氧化物的選擇性攝取[8]，以避免累積的脂質氧化產物對HDL結構和功能產生損害。

在性腺、腎上腺等組織中，也可發現SR-B1的大量表達。性腺組織合成的性激素是一類甾體激素，卵巢所分泌的兩種性激素——雌激素與孕激素，分別由卵泡內的顆粒細胞和排卵后形成的黃體細胞合成并分泌。研究發現，小鼠卵巢黃體細胞的SR-B1基因沉默后其胞內膽固醇濃度顯著降低[9]，而大鼠卵巢顆粒細胞的CE攝取過程也被證實與SR-B1密切相關[10]。也就是說，SR-B1在卵巢性激素的合成過程中發揮了一定的作用。

2.SR-B1介導胞內游離膽固醇的外流：在符合膽固醇濃度梯度的條件下，細胞表面的SR-B1還可介導胞內游離膽固醇(free cholesterol，FC)流向胞外成熟的HDL顆粒[11]。

巨噬細胞表面主要存在三種分子可介導胞內FC的外流：SR-B1，三磷酸腺苷結合盒轉運體G1(ATP-binding cassette transporter G1，ABCG1)，和三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)。SR-B1和ABCG1主要介導胞內FC外流至HDL顆粒，ABCA1則負責將磷脂和FC轉運至胞外缺乏脂質的載脂蛋白AI(apolipoprotein AI，apoAI)或載脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)上。在人巨噬細胞中，ABCA1和SR-B1是膽固醇外流的主要途徑[12]。顯然，在ABCA1途徑缺陷的情況下，作為抗動脈粥樣硬化的協助環節之一，SR-B1介導巨噬細胞內FC外流的重要性就顯得尤為突出。接受ABCA1/SR-B1雙敲除小鼠骨髓的LDLR基因敲除(LDLR-/-)小鼠，其體內動脈粥樣硬化的發展程度遠遠高于接受ABCA1基因敲除小鼠骨髓的LDLR-/-小鼠水平[13]，這一現象也就可以得到合理的解釋。

3.SR-B1的抗炎、抗氧化作用：多項研究結果表明，SR-B1與機體內促炎細胞因子水平密切相關[14]。在受到炎性因子的刺激時，核轉錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)可被激活，從而進一步提高炎性因子的轉錄水平，而SR-B1與配體的結合可活化蛋白激酶B，并同時抑制NF-κB的激活[15]，使得抗炎因子分泌增加[14]。當SR-B1介導的上述通路被阻斷時，炎性細胞因子和活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生增多，過高的炎癥和氧化應激水平最終可導致細胞凋亡。

作為抗炎的重要角色之一，糖皮質激素(glucocorticoid，GC)的合成也與SR-B1密切相關。小鼠體內的SR-B1缺陷可導致GC合成減少[16]，且Sophie等[17]通過實驗證實，小鼠腎上腺皮質SR-B1的缺失可導致應激GC水平下降，全身炎癥反應加劇，內毒素血癥致死率顯著上升。

另一方面，WT小鼠中的HDL關聯蛋白，對氧磷酶1(paraoxonase 1，PON1)、血小板活化因子乙酰水解酶(platelet-activating factor acetylhydrolase，PAF-AH)等，可通過抑制LDL的氧化修飾達到抗氧化的作用。而SR-B1-/-小鼠血清中PON1和PAF-AH蛋白水平較WT小鼠均顯著下降，PON1活性明顯降低，且其體內脂質和蛋白氧化水平顯著高于WT小鼠，證實SR-B1-/-小鼠體內氧化應激水平較WT顯著升高[8]。

二、SR-B1-/-雌鼠的病理表現及其不孕的可能機制

1.SR-B1-/-雌鼠的激素水平缺陷：膽固醇是類固醇激素合成的主要原料[18]，SR-B1作為HDL受體，在調節類固醇合成細胞攝取高密度脂蛋白膽固醇(HDL cholesterol，HDL-C)，為激素合成提供原材料的過程中發揮重要作用[10]。基于此，“激素合成不足”假說被提出。

Trigatti等[19]發現SR-B1-/-雌鼠卵巢脂質的油紅O染色顯著弱于WT雌鼠卵巢，但交配相同天數后的SR-B1-/-與WT雌鼠血漿孕酮水平并無顯著差異，且SR-B1-/-雌鼠的動情周期、排卵數目與對照組相比并無缺陷。隨后，Jiménez等[20]對同時給予HCG促排卵處理的SR-B1-/-和WT雌鼠血漿孕酮水平進行檢測，發現處于黃體期的SR-B1-/-雌鼠孕酮水平較WT雌鼠下降了約50%。

同年，Kolmakova等[21]構建了SR-B1缺陷的人顆粒細胞模型，檢測其孕酮分泌及相關蛋白表達的水平。在各種培養條件下，SR-B1 Knockdown(SR-B1 KD)顆粒細胞的孕酮分泌水平均顯著低于對照組顆粒細胞，且SR-B1 KD顆粒細胞中多種類固醇合成關鍵酶，如P450膽固醇側鏈切除酶(P450 side-chain cleavage，P450 SCC)、3β-羥化類固醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3βHSD)、類固醇合成快速調節蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)，其RNA表達水平均顯著下降。SR-B1可能通過調節StAR、SCC、3βHSD等多種類固醇合成途徑中的關鍵蛋白的表達，從而影響顆粒細胞的孕酮分泌。

以上一系列的研究結果證實，SR-B1-/-雌鼠卵巢能夠合成一定水平的類固醇激素以維持器官的一些基本功能，但在應激(促排卵)條件下，歸因于激素合成關鍵酶的低表達或其他因素，機體能夠動員利用的激素水平是相對不足的。

這種一定水平上的激素缺陷是否直接導致SR-B1-/-雌鼠不孕，Miettinen等[22]的研究對此做出了一個回復。研究人員以重組激活基因2敲除(reconstruction activating gene 2-/-，RAG-2-/-)的免疫耐受雌鼠為受體，手術切除其原卵巢后將SR-B1-/-雌鼠卵巢移植到其體內，再將其與WT雄鼠配對。術后的2～3周，SR-B1-/-卵巢移植的RAG-2-/-雌鼠中即有成功受孕鼠，最終妊娠率高達85.7%(6/7)。

在SR-B1正常表達的卵巢外環境中，SR-B1-/-卵巢可順利產生功能性卵母細胞，并維持正常功能至成功妊娠。該項研究結果也從側面證實，SR-B1-/-雌鼠不孕的原因不應僅局限于卵巢激素的合成缺陷，更多應該關注于紊亂的卵巢外環境。

2.SR-B1-/-雌鼠的失調性膽固醇代謝：在正常的RCT過程中，HDL中的FC在膽固醇脂酰轉移酶(lecithin-cholesterol acyl transferase，LCAT)的作用下酯化為CE進而被細胞選擇性攝取。上述膽固醇酯化的過程降低了體內FC的濃度，可有效地避免膽固醇過量蓄積引起的細胞功能障礙甚至凋亡或壞死的細胞毒性[23]。

SR-B1-/-小鼠體內RCT途徑的受阻直接導致膽固醇代謝的一系列紊亂，具體表現為以FC升高為主的高膽固醇血癥，其血漿游離膽固醇與總膽固醇(total cholesterol，TC)的比值(FC/TC)約為對照組兩倍(0.5 vs. 0.25)，而作為決定該比值的關鍵因素，LCAT在SR-B1-/-小鼠肝臟的mRNA表達水平和血漿中的蛋白水平與WT相比均無顯著差異[24]。針對LCAT活性的檢測發現，SR-B1-/-小鼠LCAT內源性酯化活性顯著低于WT水平[24-25]，但在加入外源性HDL-C的條件下，SR-B1-/-的LCAT外源性酯化活性與WT并無顯著差異[25]。上述結果提示，SR-B1缺陷引起的HDL顆粒體積和成分的異常變化對于LCAT活性有很大影響，可進而導致FC向CE轉化的酯化率降低，體內FC過量蓄積。

考慮到過量FC的細胞毒性與SR-B1-/-雌鼠不孕的可能聯系，Yesilaltay等[25]構建了表達人LCAT的轉基因SR-B1-/-小鼠模型(SR-B1-/-/LCATTg)對此進行研究。與非轉基因組(SR-B1-/-)相比，轉基因組小鼠LCAT外源性活性升高7～11倍，SR-B1-/-/LCATTg組FC/TC比值相比于SR-B1-/-組顯著下降(0.37 vs. 0.44，P<0.001)，但仍比WT/LCATTg組值(FC/TC=0.18)高出約一倍。值得注意的是，SR-B1-/-/LCATTg組雌鼠的妊娠率(2/15)與SR-B1-/-組(0/7)相比具有顯著差異。盡管SR-B1-/-雌鼠中LCAT的外源性活性升高近10倍只能部分改善其膽固醇酯化缺陷，但仍可有效地逆轉不孕。

后期進一步的實驗發現，SR-B1-/-雌鼠卵母細胞中FC水平遠遠高于WT雌鼠，且前者易發生過早激活，即在未受精的情況下，自動跳過減速分裂MII間期，排出第二極體。在體外膽固醇負荷的培養條件下，WT雌鼠卵母細胞出現了相同的現象[26]。

上述結果證實，過多的FC蓄積很有可能是造成SR-B1-/-雌鼠不孕的原因之一，而促進FC向CE的轉化可有效逆轉其不孕。

3.SR-B1-/-雌鼠的炎癥與氧化應激：早有多篇文獻報道，母體內的氧化應激水平可影響卵母細胞和胚胎質量，甚至可誘發多種妊娠并發癥，如子癇前期、復發性流產等的發生[27]。

SR-B1缺陷引起的炎癥、氧化應激與多種機制有關。除上述提及的促炎與抗炎因子的表達失衡、GC合成減少及抗氧化酶活性降低等因素外，SR-B1缺陷還可引起膳食成分中的抗氧化物(如β-胡蘿卜素和α-生育酚)生物利用度下降[28]。α-生育酚(α-tocopherol，α-T)是脂溶性維生素E最具生物活性的形式，也是人體內最主要的抗氧化物之一。維生素E最早作為一種嚙齒類動物正常生育所必須的微量營養素而被發現，且動物研究證實，在胚胎植入過程中回補維生素E可部分挽救由于維生素E缺乏所導致的不孕[29]。維生素E被腸上皮細胞所吸收，而這一過程有腸上皮細胞表面SR-B1的參與[28]。在循環中，LDL和HDL是α-T的主要運載體，細胞通過相應的脂蛋白受體攝取α-T[30]。相比于WT雌鼠，SR-B1-/-雌鼠血漿α-T的水平升高，但卵巢組織中α-T水平明顯下降[31]。前期研究表明，SR-B1-/-雌鼠的不孕與其植入前胚胎的發育能力異常有關[19]。SR-B1-/-雌鼠卵巢內的低α-T水平可能加劇卵巢內氧化應激狀態從而影響卵泡的正常發育，最終導致不孕。

在正常妊娠期間，母胎界面的母體面和胎兒面均有SR-B1的表達[32]。胚胎植入后的發育階段中，母體循環中的脂蛋白α-T轉運入胚胎的過程依賴于此界面中的SR-B1分子。已有研究證實，胚胎期維生素E的缺乏可引起胚胎宮內發育遲緩及出生后各種形態和功能上的異常[32-34]。SR-B1-/-小鼠胚胎在發育期間的α-T攝取不足甚至可導致神經管閉合障礙，最終引起胎鼠的圍產期死亡[35]。SR-B1+/-雜合雌鼠與SR-B1-/-雄鼠配對后代中，SR-B1-/-仔鼠所占比例明顯少于孟德爾遺傳定律的50%，也就得到了合理的解釋。

三、總結與展望

SR-B1-/-雌鼠的不孕可能涉及到多重機制。就激素水平而言，應激條件下的激素缺陷似乎并不能對此作出完全的解釋；膽固醇代謝方面，通過促進SR-B1-/-雌鼠體內的FC向CE轉化，可有效逆轉其不孕，這一結果明確了過量FC蓄積可引起的生育毒性；此外，SR-B1-/-雌鼠體內異常升高的炎癥與氧化應激水平可能干擾了卵母細胞和胚胎的正常發育，推動了不孕的發展。

SR-B1-/-雌鼠不孕的機制尚未完全明確，相關的機制假說仍需進一步的實驗證實。對于臨床不孕女性患者，可針對其SCARB1基因展開一定的檢測，結合動物模型的相關實驗數據，分析結果可能更有說服力。

針對SR-B1與女性不孕的相關研究為女性不孕的病因學提供了一個新的診斷方向，也為不明原因的不孕提供了一個新的治療方向。