3D生物打印在口腔頜面部的應用前景

姚 潔，蔡禮釗，劉湘寧，王亞玉，賴仁發

暨南大學1口腔醫學院,2生命科學技術學院/生物醫藥研究院，廣東 廣州 510630

對于創傷、腫瘤和遺傳等因素導致的頜面部軟硬組織缺損及畸形的修復，一直是口腔醫學的臨床難題。近年來，隨著再生醫學、生物材料學科及計算機科學的飛速發展及融合，修復頜面部組織缺損的研究熱點已轉向仿生材料修復以及組織器官的再生修復。3D生物打印技術的發展正印證了這一學術潮流。以組織器官的再生修復為目標的3D生物打印為頜面部組織的精細化修復帶來了新的思路和希望。本文圍繞著3D生物打印在口腔頜面部的應用進展進行簡單概述。3D打印的概念在1986年首次提出，3D打印的作用原理即將材料薄層打印出后再用紫外光固化，疊加在一起，得到三維立體模型[1]。3D生物打印則是引用3D打印的理念，利用生物材料或者活細胞逐層疊加構造，形成一定的仿生形態或細胞微環境，即形成具有三維立體結構的生物功能體[2]。

1 純生物材料生物打印（無生命的）

單純的生物材料打印不涉及細胞的打印，常見生物材料分為金屬和非金屬材料[3]（醫用高分子、生物陶瓷、生物衍生材料等）。常用的金屬材料包括純鈦和鈦合金、鎂及鎂合金，多用于牙種植以及頜面骨缺損的修復。Qassemyar等[4]在兩位分別因成釉細胞瘤和鱗狀細胞癌造成下頜骨缺損，需要進行骨重建但無法從自身提取骨游離皮瓣的患者身上，利用3D生物打印定制了多孔鈦假體，從而代替骨游離皮瓣進行修復。大多數金屬生物支架是不可降解的，不經手術難以取出，往往給患者帶來二次傷痛以及經濟負擔。這也使研究人員對生物可降解金屬的產生了濃厚興趣。Wang等[5]將AZ31型鎂合金設計成牽引裝置，在切除單側下頜骨的雜交犬身上進行牽張成骨實驗。研究分別用AZ31鎂合金和不銹鋼作對照，結果顯示新型生物材料AZ31鎂合金對成骨的誘導結果與不銹鋼相似，在生物體內可以降解，對肝、腎無毒性作用。研究人員還在研究如何控制生物材料的降解速率，如Hong等[6]通過3D打印精確控制生物可降解鐵錳合金中鈣的含量，發現鈣可以提高傳統的鐵錳合金的降解速率，相信在不遠的將來，3D生物打印的可降解鐵錳-鈣合金在骨缺損修復確有可行之處。

非金屬材料常見的有生物陶瓷、醫用復合材料、生物衍生材料等[3, 7-9]；其中又以生物陶瓷最為常用，生物陶瓷是一類與人體骨組織成分相似，可以誘導骨的形成的材料[8]，常用的生物陶瓷成分主要有羥基磷灰石和磷酸三鈣。羥基磷灰石是骨和牙齒的主要成分，作為人工骨的早期替代材料，其生物相容性良好，但強度低、脆性大；磷酸三鈣作為人體硬組織修復材料則具有良好的生物相容性和降解能力[7]。將二者的特性結合起來，制作具有二者優點的復合材料的研究從未間斷。研究人員利用3D打印技術制備由羥基磷灰石/β-磷酸三鈣（HA/β-TCP）組成的雙相磷酸鈣陶瓷（BCP）支架，研究其在骨組織工程中的應用潛力，發現骨髓基質干細胞在此支架上黏附良好[10]。Ga?pari?等[11]將羥基磷灰石和納米纖維素結合，并進行疏水化處理，研究其與人成骨細胞的相容性，發現成骨細胞在支架材料與膠原/磷灰石基質上具有相似的生存能力。將含有銀離子的磷酸三鈣支架運用在頜面部缺損修復中，可持續性提供銀離子釋放，在一定程度上緩解術后感染的風險[12]。

這些生物材料根據不同的要求，通過不同的3D打印技術，例如噴墨打印技術、選擇性激光燒結技術、光固化成型技術和熔融沉積技術等，在體外可以形成具有一定生物功能的生物醫學產品。

2 以活細胞為基礎的生物打印（有生命的）

有研究2003年提出了“細胞打印”的概念，隨后形成了以活細胞為基礎的3D生物打印技術，即將活細胞和生物支架材料混合輸出并逐層疊加，形成具有三維立體結構的有生命的生物功能體[1]。到目前為止能進行3D打印的細胞種類繁多，已經涉及到人體的組織的各類細胞，例如成骨細胞、骨髓基質干細胞、微血管內皮細胞、人類纖維組織細胞和人脂肪干細胞等[13-16]。根據打印方式的不同細胞打印通常可以分為噴墨打印、激光直寫、聲控打印[15, 17-18]。以細胞打印為基礎的3D生物打印是最前沿的生命科學技術，以此為基礎的人工組織與器官構建技術具有巨大的科學意義與應用價值。

2.1 細胞打印的方式

2.1.1 噴墨打印 噴墨打印目前應用廣泛，是最早應用于細胞打印的技術之一，它是一種非接觸式的打印方式。噴墨打印的“生物墨水”是一種包含了活細胞、細胞培養基質以及其他生物物質的一種共混物。最常見的噴墨產生方式是利用機器腔內的熱應力產生擠壓力，使噴頭噴出定量的墨水，或是利用壓電晶體在電壓作用下發生形變，產生壓力，將墨滴噴出噴嘴，精確控制液滴位置。噴墨打印雖然技術難度不高，分辨率好，然而也存在技術短板：若使用的“生物墨水”較為粘稠，不僅容易導致噴墨沉積不均勻，噴墨打印機的噴嘴很容易被堵住，這是研究人員需要克服的難關。

2.1.2 激光直寫 激光直寫，是利用激光束對細胞的作用力，使細胞發生移動，到達指定的位置。該打印系統主要由脈沖激光束源、聚焦系統、目標板和接收板組成。3D生物打印激光直寫為防止激光對細胞直接作用，采用可吸收紫外光的目標基板吸收激光束的能量。在其下方則放置一塊接收板。在打印過程中，利用激光聚焦于目標板上，將細胞懸液打到接收板上面，從而完成打印。這種打印方式的分辨率高，精確度好，細胞與細胞之間不會發生污染，是完全沒有堵塞噴嘴風險的打印方式。但同時，效率低下和激光造成細胞損傷、溶液蒸發的問題也困擾著研究者。

2.1.3 擠壓打印 擠壓打印可用于高粘度的生物墨水打印，通過機械螺栓或者氣動裝置擠壓液體腔，長絲從噴嘴里連續流出。印刷速度由氣動壓力以及機械螺栓的位移決定。此種打印方式準確，連續且成本低。然而對壓力敏感的細胞打印成活率低的問題難以解決，高濃度的生物墨水依然容易造成噴嘴堵塞。

2.2 細胞打印的支架材料研究

以活細胞為基礎的生物打印的組成材料為活細胞和生物支架材料，生物支架材料顯得格外重要，一方面要求與細胞有很好的相容性，具有良好生物降解功能，另一方面，需要一定的強度，供細胞粘附增殖。常用的支架材料有水凝膠、纖維蛋白原等。宋楊等[19]構建了人脂肪間充質干細胞-生物材料共混物三維打印體，獲得的細胞—海藻酸鈉一明膠共混物經過體外培養一周，將其植人裸鼠背部皮下。結果顯示實驗組打印體中有類骨組織形成。Yang等[20]用海藻酸鈉（SA）混合的膠原型I（COL）或瓊脂糖，作為3D生物墨水，結合軟骨細胞構建體外3D生物打印軟骨組織，結果顯示SA/COL可以明顯促進細胞粘附，加速細胞增殖。Pati等[21]利用脫細胞的脂肪組織和人脂肪組織干細胞制作生物墨水，經3D生物打印后體外培養后植入小鼠后背，該結構沒有引起慢性炎癥反應，反倒是促進了局部組織重建和脂肪組織形成。有活細胞參與的3D生物打印，往往比單純的支架材料植入效果好，具有一定增殖、自我修復功能，可促進局部組織愈合，提高組織重建能力，以期恢復組織結構的生理功能。細胞打印是日后組織器官重建與移植的基礎。

3 以3D生物打印為基礎的組織器官構建

目前可以經過3D生物打印的器官組織有肝臟、腎臟、皮膚、血管等。研究表明，大多數體外肝臟組織模型只能模擬二維環境，在較短的時間就會喪失功能，Grix等[22]利用肝素和人星狀細胞結合，用3D生物打印的方式，組成一個復雜的三維結構，經過兩周培養，各項生化檢測顯示正常。Kizawa等[23]利用無支架的3D生物打印技術構建一小部分肝臟組織，可穩定代謝藥物、葡萄糖和脂質。Sochol等[24]討論了體外單層腎臟模型可利用3D打印技術，形成具有功能替代性的結構。不少研究者著眼于皮膚這一身體中最大的一個器官，有學者研究了一種可引導皮膚再生的生物墨水混合細胞進行皮膚組織打印，實驗證明3D生物打印的皮膚組織物理形態穩定，沒有明顯萎縮[25]。單純打印血管組織并不困難，難點在于植入體內后發揮運輸功能，Lee等[26]對3D生物打印血管網系統的生成進行了研究，成功研制出一種3D打印的射血通道，可與附近的毛細血管網建立灌注血管通道。至此，可見3D生物打印技術取得了一定的發展。

然而，諸多3D生物打印的產物目前只是在體外實驗獲得成功，目前的組織器官尚不能用于人體，在人體內行使功能。人體器官具有復雜性和多樣性，在人體內部構成一個有機整體，內部環境需要血管網絡相交通，以傳遞營養。如今的3D打印技術能夠很好的實現細胞的空間位置排布，但實際上是缺少血管網這類有效通道結構的。劉翀等[27]就利用現有的三維支架，利用計算機模擬，在其上建立模擬血管通路，以期得到包含血管通路網的三維支架。而Jia等[28]利用明膠、海藻酸鈉和4-arm聚乙二醇組成的生物墨水，與多層同軸擠壓系統結合使用，經過細胞增殖，形成了具有生物組織性、可灌注的血管結構。組織的血供完善是3D生物打印發展道路上亟待解決的問題，若能解決這個問題，頜面部修復中關于皮膚移植的難題也能迎刃而解[29]。

4 3D生物打印在口腔頜面部的應用前景

目前3D打印在口腔頜面部應用較為局限，主要是純生物材料的3D打印，例如鈦金屬經3D打印成種植體精確性良好，有報道稱鈦合金根形種植體在臨床應用中獲得成功[30]，有效地利用金屬或非金屬的生物材料打印為頜骨支架，如王寧等[31]就利用3D純生物材料打印技術，打印了鈦合金下頜骨，為因切除左下頜骨腫瘤造成骨缺損的患者進行頜骨重建。Lee等[32]則利用納米羥基磷灰石/聚酰胺（n-ha/PA）作為支架材料修復了髁狀突缺損，恢復了面部外形。這類技術的運用為頜面部缺損修復提供便利，節省手術時間，提高了修復效果。頜面部骨組織外側有層層包裹的肌肉、皮膚，其中有錯綜復雜交疊的血管和神經。對于以活細胞為基礎生物打印，涵蓋了軟骨及骨組織、皮膚、血管、神經等組織的相關打印技術，同樣適用于口腔頜面部軟骨及骨組織、皮膚、血管、神經等組織的重建。Li[33]發現關節軟骨內提取內源性的祖細胞（ACPCs）可經3D生物打印用于顳下頜關節盤損傷修復。

綜上所述，3D生物打印是純生物材料的打印，同時包含了以活細胞為基礎的生物打印。3D細胞打印可通過噴墨打印、激光直寫、擠壓打印等方式在細胞多樣性的選擇及三維構筑結構的精確性上有很大進步，但仍需克服諸如復雜結構的多細胞打印、直徑大液滴打印等問題。如今已有體外構建有功能的人體組織器官的報道，隨著新型生物材料的更新和細胞支架材料制造技術的發展，相信隨著科技的不斷發展，以組織器官的再生修復為目標的3D生物打印為頜面部組織的精細化修復是口腔頜面部組織修復的必然發展方向，有著廣闊的科學研究和臨床應用前景。