利用概率估算提高植物品種分子標記鑒定的準確率

周俊飛，崔野韓，唐浩，李論，陳紅，溫雯，韓瑞璽，黃思思，方治偉，彭海

（1江漢大學系統生物學研究院，武漢 430056；2農業部科技發展中心，北京 100122）

0　引言

【研究意義】依據現有的標準進行植物品種分子鑒定是植物品種權授予、品種審定、種業市場管理與品種權案件判決的重要依據。然而，現有的品種分子鑒定標準僅檢測了植物品種基因組上部分分子標記位點，存在抽樣誤差，但標準中并沒有給出抽樣誤差的估算方法與鑒定結論的可靠性估算方法，導致鑒定結論在應用中常被質疑是否可靠。估算并驗證分子標記位點的抽樣誤差與鑒定結論的可靠性，為品種分子鑒定標準的各種應用提供科學依據。【前人研究進展】植物品種鑒定分為田間表型測試與分子標記測試2種方法。田間種植鑒定通過觀察申請品種與近似品種在相同生長條件下的性狀差異，判斷申請品種是否存在特異性。為保證鑒定結果的可靠性，田間試驗通常需持續2—3年。田間表型測試具有周期長、受環境影響等缺點。分子標記測試則不受環境影響，可以快速檢測品種間的異同，從而輔助實現品種快速授權或品種權侵權案件的判決。分子標記鑒定方法通過對分子標記位點進行檢測，將申請品種與近似品種間的差異標記數與規定的閾值進行比較，判斷兩者是否為不同的品種。目前，品種分子標記鑒定主流技術為微衛星（simple sequence repeats，SSRs）標記。SSR標記是利用基因組內廣泛存在的、中性的簡單重復序列的長度變異鑒定品種，具有標記多態性高[1]、鑒定方法簡單、種內[2-3]甚至種間[4-6]通用等突出優勢。目前，大多數植物品種分子鑒定行業標準或者國家標準都是根據SSR標記制定的。然而，SSR標記具有檢測通量低等不足，有逐步被單核苷酸變異（single nucleotide polymorphisms，SNPs）標記所取代的趨勢，目前，部分作物如水稻[7]等已經基于 SNP標記制定了品種鑒定的行業標準。【本研究切入點】任何分子標記方法都只能鑒定品種基因組上的部分位點，必然存在標記位點的抽樣誤差。大多數基于SSR標記的品種分子鑒定標準的標記位點數不足50個，抽樣誤差十分明顯。因而，利用現有的品種分子鑒定標準獲得的鑒定結論用于品種權授權、品種審定和解決品種權糾紛時，可靠性常常被質疑。然而，現有的植物品種分子鑒定標準中均無標記位點誤差與結論可靠性的計算方法，相關研究也十分有限。【擬解決的關鍵問題】本研究估算了品種分子標記鑒定的位點抽樣誤差與結論的可靠性，進而將品種間關系劃分為紅區、綠區和黃區，對應高概率保障為相同或近似品種、高概率保障為不同品種和無概率保障的待定品種，為品種分子鑒定的行業標準與國家標準的應用提供了科學依據。

1　材料與方法

1.1　品種間關系鑒定的概率模型

設品種分子鑒定的行業標準或國家標準中規定的檢測位點的數目為N個，品種A和B間觀察到的差異位點的數目為 x（x≤N）個。標準中規定區分相同和不同品種的差異位點的數目的閾值標準為 n（n≤N）個。那么，根據行業標準或國家標準，若x＜n，則判定品種A和B為相似或相同品種，否則，為不同品種。

由于N個檢測位點只是基因組上所有標記位點的一次抽樣，因此，觀察到的差異位點的數目x值的大小存在抽樣誤差。排除抽樣誤差后，品種A和B間的真實的差異位點（后文稱為期望的差異位點）數目 t值可以更加準確地判定品種A和B的關系。根據分子鑒定標準，品種A與B為相同品種的概率為P=∑0≤t＜nP(t|x)，其中，P(t|x)為觀察到的差異位點的數目為 x的條件下，期望的差異位點的數目為t的條件概率。根據貝葉斯公式：

設接受品種A與B為相同品種的概率保障為1-α，那么，當P≥1-α，品種A與B的關系落入紅區，判定它們為相同品種或近似品種；當P≤α時，品種A與B的關系落入綠區，判定它們為不同品種；當α＜P＜1-α時，品種A與B的關系落入黃區，無法準確判定它們之間的關系。

1.2　品種間關系鑒定的概率模型的驗證

水稻品種分子鑒定標準[8]規定的檢測位點為N=48個SSR標記位點，區分相同與不同品種的差異位點的數目，即判定閾值 n=2。為驗證概率模型，共選擇了8個水稻品種，利用AmpSeq-SSR的方法為每個品種鑒定了3 205個SSR標記位點，品種的具體名稱見表1，SSR標記位點選取、檢測方法與檢測結果見我們近期發表的論文[9]。3 205個標記位點抽樣量較大，抽樣誤差小，因此，品種間期望的差異位點的數目可以估計為其中，M（M≤3 205）為兩品種中均成功獲得了基因分型的檢測位點的數目；m為共同檢出位點中，觀察到的差異位點的數目。根據水稻分子鑒定標準，當t＜n=2時，兩品種為相同或相似品種，否則為不同品種，該判定結果為品種間關系的參考值。

從2個品種共同檢測位點中隨機抽取N=48個檢測位點，獲得每次抽樣中觀察到的差異位點的數目，即x的值。根據公式（2）計算P值，并與設定的α值比較，判定品種間的關系，稱為品種間關系的判定結論。將品種間關系的判定結論與參考值比較，驗證判定結論是否正確。

2　結果

2.1　利用概率模型可以準確鑒定品種間關系

對8個水稻品種的28對組合的3 205個SSR標記的分型結果進行了10 000次N=48個標記位點的隨機抽樣，每一次隨機抽樣相當于利用水稻SSR標記鑒定的行業標準[8]對一對品種進行了一次鑒定。利用公式（2）所示的概率模型，根據每次隨機抽樣結果判定品種組合間的關系，并驗證判定結論的正確性，具體過程見材料與方法部分。結果表明，每個品種組合有 4 295—10 000（42.95%—100%）次隨機抽樣在1-α=0.95的概率保障下，明確判定為不同品種（表1），品種間關系落入了綠區。把表1中的t值與水稻SSR標記鑒定的行業標準[8]中的判定閾值n=2比較，獲得每一對品種組合間關系的參考值。品種組合間關系的參考值與判定結論比較表明，所有（100%）判定結論均是正確的，表明利用概率模型獲得的品種間關系的判定結論的準確性很高。

2.2　概率模型在品種權案件判決中的應用實例

最近（2017年8月3號），根據西瓜品種‘美豐’與‘欣美’間觀察到的差異位點的數目x=7個，合肥市中級人民法院判決它們之間不構成品種權侵權；根據‘美豐’與‘輝煌818’，‘美豐’與‘興隆 188’之間觀察到的差異位點的數目 x=0個，判決它們之間構成品種權侵權。但敗訴方認為西瓜分子鑒定標準[10]只檢測了 N=28個位點，質疑判決的可靠性。

西瓜分子鑒定標準中，相同與不同品種的判定閾值n=3，根據公式（2），當x=7時，為相同品種的概率P=2.49×10-3≤α=0.05。因此，‘美豐’與‘欣美’在95%的概率保障下落入了綠區，為不同品種，不構成侵權的判決是可靠的。當x=0時，P=2.96≥1-α=0.95，因此，‘美豐’與‘輝煌 818’，‘美豐’與‘興隆188’在 95%的概率保障下落入了紅區，為相同或相似品種，構成侵權判決也是可靠的，敗訴方質疑的理由并不充分。

表1　利用概率模型可以準確判定品種間關系Table 1　The relationship between varieties can be determined by probability model

3　討論

3.1　假設t值服從均勻分布的理由

差異大的品種可以根據性狀直接判定為不同品種，也就是說，多數情況下，利用分子標準鑒定的品種差異不大。因此，期望的差異位點的數目t值接近于品種鑒定標準中區分相同與不同品種的判定閾值n，且t值與n值之間的差值大小接近隨機事件，導致t值的分布服從于以n為平均值的平緩的正態分布，即t～N(n, σ2)。當在授權審查或案件判決中，獲得多對性狀間差異不大的品種間的 DNA分子標記差異數量的實測值后，就可以計算出 σ2的值和公式（1）中的先驗概率 P(t)的值，最終精確計算出相同品種的后驗概率P值并精確判定品種間的關系。

當品種間 DNA分子標記差異數量的實測值數據有限，導致不能或不能準確計算公式（1）中的先驗概率P(t)的值時，可用t值的均勻分布近似估計正態分布，將公式（1）轉化為公式（2），實現相同品種的后驗概率P值的估算。由于t值的分布服從于以n為平均值的平緩的正態分布，因此，近似為均勻分布是合理的。根據相同品種概率P值的計算公式的原理，將正態分布近似為均勻分布，所產生的效應僅是略為增加判定品種間關系的黃區的范圍，同時略為縮小紅區與綠區的范圍。也就是說，使用近似的均勻分布，不能明確獲得品種間關系的機會略有增加，但獲得的明確鑒定結論更加可靠，這符合品種授權與案件判決對品種鑒定結論的精準性的要求。

當品種間差異較大，即 t值與 n值之間的差值較大時，無論是采用均勻分布還是正態分布，為相同品種的后驗概率P的值都很低，因此，均可正確地判定出它們為不同的品種。事實上，表1中差異大的品種間的關系判定全部得到了驗證，表明均勻分布的假定基本不會影響差異大的品種間關系判定的準確率。

總之，假定t值服從均勻分布，實現了相同品種的后驗概率P值計算的同時，對品種間關系判定結論的準確性也基本無影響。

3.2　現有品種分子鑒定標準中檢測位點不足導致鑒定結論不明確

現有的大部分基于SSR標記的品種鑒定標準中規定的檢測位點都較少，例如，水稻品種分子鑒定標準[8]規定檢測位點數僅為N=48個。即使在品種間沒有觀察差異分子標記位點，即x=0，根據公式（2），它們為相同品種或相似品種的概率 P=0.87，落入了黃區，無法在1-α=0.95的概率保障下，判定為相同或近似品種。事實上，表1顯示每個品種組合中有0—5 705（0—57.05%）次抽樣，不能在 1-α=0.95的概率保障下得到品種組合間關系的明確結論，品種組合間關系落入了黃區，需要結合其他證據如田間測試結果進行判定。

增加品種分子鑒定標準中檢測位點的數目可解決品種間關系鑒定結論不明確的問題。假設將水稻品種分子鑒定標準[8]中檢測位點數量和判定閾值同時擴大10倍（N=480且n=20），那么，判定相同與不同品種間的分子差異水平并沒有改變。若在品種間依然沒有觀察到差異標記位點（x=0），那么根據公式（2），它們為相同或相似品種的概率 P=1.00。也就是說，幾乎有絕對的把握保證這品種間的分子差異在標準規定的判定閾值之下，可以明確地判定為相同或相似的品種。

總之，增加分子鑒定標準中檢測位點的數量，可以更精準地評估品種間分子差異水平，增加具有明確判定結論的紅區與綠區的范圍，縮小不具有明確判定結論的黃區的范圍。

3.3　分子標記鑒定在品種鑒定中的作用與地位

品種分子鑒定存在以下局限。首先，分子鑒定標準只抽檢基因組上部分位點，存在抽樣誤差，不能準確說明品種間的分子差異水平。本研究為品種分子鑒定結論賦予了概率保證，減少了因檢測位點不足導致的爭議。第二，分子標記分型技術無法做到絕對準確，導致品種間分子差異的假陽性與假陰性。例如，SNP分型的技術誤差超過1%[11-12]，聚合酶滑動[13-19]也造成大量 SSR標記分型錯誤[9]。最近發明的AmpSeq-SSR技術有效解決了SSR標記檢測位點不足與分型錯誤的問題[9]。第三，堿基突變率約為10-9/世代[20]，而多數作物基因組超過109個堿基，導致相同品種間也可能存在約2個標記的差異。因此，存在差異的分子標記不能直接作為不同品種的判定依據。

品種鑒定是品種權授權與案件判決的依據，需同時滿足科學與法律的嚴謹性，需要邏輯完整的解決方案。品種分子標記鑒定彌補了性狀鑒定速度慢的不足，但《種子法》是基于性狀定義品種的，決定了分子標記鑒定不具有最終的法律地位。品種間分子標記差異位點的多少反應了它們為相同或不同品種概率的大小，可以依據概率大小快速作出預授權或判決，以充分利用分子標記鑒定速度快的優勢。然而，類似于刑事案件，分子標記鑒定結果的孤證不足以成為最終定案依據。當預授權或判決存在爭議時，可根據分子鑒定結果確定舉證責任方，舉證責任方可以根據性狀測試結果，論證請求的合理性。

4　結論

構建了一個評估品種間關系判定結論可靠性的概率模型，利用該概率模型鑒定的品種間關系的準確率為 100%。為品種間關系的分子鑒定結論賦予了概率保證，提高品種間關系判定結論的準確性，避免因檢測位點不足導致的爭議。

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