油菜主花序角果密度及其相關性狀的全基因組關聯分析

任義英，崔翠，王倩，唐章林，徐新福，林吶，殷家明，李加納，周清元

（西南大學農學與生物科技學院，重慶 400715）

0　引言

【研究意義】油菜是世界上主要的油料作物，在中國是繼水稻、小麥、玉米、大豆之后的第五大作物，也是中國食用植物油和動物飼料的重要來源[1-2]。角果是主要的光合器官，具有“庫”和“源”的雙重作用[3-4]。適宜的角果密度可以提高光能利用率，增加籽粒數量，從而提高油菜產量[5-6]。主花序角果數和主花序長是主花序角果密度的組成型性狀，分別反應了主花序角果的分布情況和植株的松散程度，對油菜產量有直接或間接的影響。因此，鑒定和定位控制主花序角果密度及其相關性狀的 QTL，對挖掘高產基因和培育高產品種具有重要的指導意義。【前人研究進展】角果密度、主花序角果數和主花序長的廣義遺傳率都較高，遺傳比較穩定，受環境因素的影響較小[7-9]。余鳳群等[10]發現角果密度和主花序長都受多基因控制，且控制角果密度的基因存在互補作用，控制主花序長性狀的基因存在重疊作用。也有研究表明，主花序有效長、主花序角果數和角果密度受顯性效應、顯性與環境互作效應以及上位性效應的影響，其中主花序有效長和主花序角果數也受加性效應控制[12-14]。隨著QTL定位方法和分子標記技術的飛速發展，推動了甘藍型油菜角果相關性狀QTL的研究進展。CHEN等[15]檢測到15個與主花序角果密度有關的QTL，單個位點的表型貢獻率在 2.79%—7.59%，其中 A06、C05、C06和C08上的4個QTL在2個群體之間共有；發現13個與主花序長度有關的QTL，單個位點的QTL貢獻率在2.58%—9.22%，在2個群體中檢測到7個重疊的QTL。高必軍[16]在第12連鎖群上檢測到1個與主花序角果密度相關的QTL，解釋17.3%的表型變異；5個與主花序有效角果數相關的QTL，依次位于第6、12、13連鎖群，單個位點可解釋性狀表型變異的11.25%—25%；15個控制主花序長的QTL，分別位于第1、2、6和17連鎖群，每個QTL分別解釋7.4%—26.6%的表型變異。陰濤[17]檢測到位于A02染色體上的2個與主花序角果密度相關的QTL，單個位點分別解釋5.25%和8.07%的表型變異；在A02染色體上發現1個與主花序長相關的QTL，可解釋6.25%的表型變異。目前，油菜角果密度及其相關性狀的QTL研究還停留在初步定位階段，后續研究報道較少。近年來，隨著一些植物全基因組測序的完成，分子標記的開發和生物信息學的迅速發展，關聯分析己成為植物數量性狀基因研究的熱點之一。關聯分析又叫連鎖不平衡作圖（linkage disequilibrium mapping，LD mapping），是一種以連鎖不平衡為基礎，根據特定的統計方法來鑒定某一自然群體內目標性狀與分子標記（或候選基因）關系的定位方法，可以直接鑒定出控制目標性狀的功能基因或基因內的功能多態性[18]。關聯分析以自然群體為研究對象，無需構建專門的分離群體，用時少，可以節約成本；可以檢測群體內與目標性狀相關一個基因座位上的多個等位基因，檢測量大；自然群體積累的重組信息大，分辨率高，能夠精細定位目標性狀，精確到單基因水平[19-20]。隨著甘藍型油菜全基因組序列的公布[21]及蕓薹屬 60 K SNP（single nucleotide polymorphism）芯片的開發，關聯分析在甘藍型油菜中的運用也取得了較大的成果，并鑒定出一些與重要農藝、品質性狀相關聯的位點[21-25]。【本研究切入點】盡管已有油菜角果密度及其相關性狀的QTL的研究報道，但多數為初步定位階段，未能進一步定位和預測候選基因。【擬解決的關鍵問題】本研究采用不同遺傳背景和地理來源的213份甘藍型油菜構建自然群體，結合SNP芯片數據及重慶北碚2年的表型數據，擬對主花序角果密度、主花序有效長和主花序有效角果數進行全基因組關聯分析，并進一步預測與性狀相關的重要候選基因，為通過分子標記輔助選擇等方式提高油菜產量提供理論依據。

1　材料與方法

1.1　植物材料

213份關聯分析材料為具有不同遺傳背景和廣泛地理來源的常規品種、品系（電子附表 1），由重慶市油菜工程技術研究中心收集并提供。

1.2　田間試驗和性狀調查

將213份材料分別在2014年和2015年10月種植于重慶市油菜工程技術研究中心歇馬實驗基地，11月份田間移栽，按完全隨機區組設計，每種材料種植 3行，每行10株，行距40 cm，株距20 cm，重復2次。待油菜成熟時，選取10株長勢相對一致的單株，測定各單株的主花序有效長（valid length on racemes，VLR）和主花序有效角果數（valid silique on racemes，VSR），并計算主花序角果密度（silique density on racemes，SDR）。主花序角果密度為主花序有效角果數/主花序有效長，以“個/cm”為單位；主花序有效長為從主花序底端第一個有效角果（有效角果，即角果中有飽滿的種子）著生部位到頂端最后一個有效角果著生部位長度，以“厘米（cm）”為單位；主花序有效角果數為主花序上著生的有效角果數，以“個”為單位。表型數據采用Excel 2016軟件進行初步整理，取2個重復的平均值，計算每個性狀的平均數、標準差和變異系數；采用 DPS7.05軟件進行統計分析和性狀間的Spearman相關性分析。

1.3　基因型測定與分析

利用油菜60 K Illumina Infinium SNP芯片對213份材料進行基因型分析，該芯片包括覆蓋甘藍型油菜全基因組的52 157個SNP標記。采用 Genome Studio（Illumina公司）軟件對213份油菜種質進行SNP基因型的檢測，挑選出雜合率（heterozygosity，H）、缺失率（miss rate，M）小于 20%，同時最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）大于10%[26]，且均勻分布于染色體上的23 767個高質量SNP標記用于后續全基因組關聯分析。

1.4　群體結構與親緣關系分析

利用 Structure 2.3.4軟件對該群體進行群體結構分析[27]，設置亞群數目K為1—10，5次模擬運算，模擬參數迭代（length of burn-in period）和蒙特卡羅迭代（markov chain monte carlo，MCMC）都設置為1×105次循環，在混合模型和頻率相關模型下運算。輸出的后驗概率值結果輸入STRUCTURE HARVESTER（http://taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/），計算2個連續的后驗概率值的變化速率（Δk）和每個材料分別來自1—10亞群的Q值，以Q值0.8為分界線，最終確定群體的數目和結構[28]。

利用 Tassel 5.1.0軟件對自然群體進行親緣關系（relative kinship）評估，計算親緣關系K矩陣[29]。親緣關系代表兩特定材料之間的遺傳相似度與任意材料之間遺傳相似度的相對值，因此當材料之間的親緣關系值為負值時，直接將其定義為0[20]。

1.5　連鎖不平衡分析

利用Tassel 5.1.0分析連鎖不平衡（LD）在甘藍型油菜各染色體上的分布，繪制各染色體的LD衰減圖[31]，LD類型參數設置為 Full Matrix，以決定系數（coefficient of determination）r2=0.2為衰減閾值，計算顯著關聯SNP所在染色體的LD衰減距離，用于候選基因預測和功能注釋分析。

1.6　最優模型的選擇和全基因組關聯分析

將基因型數據導入Tassel5.1.0后進行主成分分析（PCA矩陣），再將Q和K矩陣導入Tassel5.1.0，以Q、K和PCA矩陣作協變量，采用基于一般線性模塊（general linear model，GLM）的GLM、Q和PCA模型和混合線性模塊（mixed linear model，MLM）的K、Q+K和PCA+K共6種模型進行關聯分析。以ggplot2[30]繪制Quantile-Quantile散點圖（QQ plot）表示不同模型的檢測效力，以實際P值與期望P值最接近的模型為每個性狀GWAS分析的最佳模型。最后基于最優統計模型，對群體內主花序角果密度及其相關性狀進行關聯檢測。用P值來衡量關聯標記的顯著性，顯著關聯SNP閾值設為1/23767=4.21×10-5。利用qqman[31]繪制Manhattan圖顯示關聯分析檢測到的與目標性狀顯著相關的標記位點。

1.7　候選基因分析

在關聯分析結果的基礎上，用與性狀顯著關聯的SNP所在染色體上r2=0.2時的衰減距離為候選基因的LD區間。根據這個區間在油菜基因組中的位置，以已公布的甘藍型油菜“Darmor-Bzh”的基因組注釋信息（http://www.Genoscope.cns.fr/brassicanapus）分析區間內的基因，并與擬南芥的基因序列進行 BLAST比對，以同源性最高的擬南芥基因注釋候選基因功能，篩選可能控制目標性狀的候選基因。

2　結果

2.1　表型統計分析

連續2年（2015年和2016年）分別對213份油菜種質的主花序角果密度、主花序有效長和主花序有效角果數的表型進行考察和統計分析（表1、圖1），結果表明，3個性狀在2年內品種間差異均達到極顯著水平，變異系數介于15.38%—26.42%，變幅較大。正態檢驗（表1）和頻數分布圖（圖1）也表明，目標性狀2年Shapiro-Wilk檢驗的W值均在0.991—0.996，且 P＞0.05，符合正態分布；兩年 3個性狀都呈連續性分布，符合典型的數量性狀特點，適合進行GWAS分析。3個性狀的廣義遺傳率分別為68.06%、67.47%和69.05%，也表明其主要受遺傳因素影響。

表1　甘藍型油菜主花序角果密度、主花序有效長和主花序有效角果數的統計分析Table 1　Statistical analysis of SDR, VLR and VSR in B. napus

2.2　油菜主花序角果密度及其相關性狀的相關性分析

2015年，主花序角果密度與主花序有效長、主花序有效角果分別存在統計學意義上的極顯著負相關和顯著正相關，相關系數分別為-0.265和 0.144；2016年，主花序角果密度與主花序有效長具有統計學意義上的有極顯著負相關。兩年主花序角果密度與主花序有效長呈極顯著負相關，意味著主花序增長，但沒有相應地增加有效角果數，因此，研究主花序角果密度對增加主花序有效角果數，提高油菜產量有重要意義。

2.3　群體結構與親緣關系分析

選擇8 923個在染色體上均勻分布且最小等位基因頻率大于0.3的SNP標記，利用軟件Structure2.3.4對每個可能的K值模擬運算，輸出結果分析后驗概率LnP(D)值得到方差以及變化速率，當K=2時，模型中顯示△K有最大變化（圖2-A）。213份甘藍型油菜分為P1和P2 2個亞群，P1亞群包含50份材料（23.5%），絕大多數源自于國內的湖北省、春性油菜和少量的半冬性材料及國外引進的材料；P2亞群包含163份材料（76.5%），主要是中國的半冬性油菜品系（電子附表1）?；跀祵W模型對群體的類群劃分，基本與油菜的地理栽培屬性一致。親緣關系分析顯示群體中約89.74%的材料之間的親緣關系值小于0.2（圖2-B），其中約有59.91%材料的親緣關系值為0，約12.01%材料的親緣關系值介于0—0.05。說明整個自然群體材料之間的親緣關系較遠，對關聯分析結果影響較小。

圖1　自然群體主花序角果密度、主花序有效長和主花序有效角果數的頻次分布Fig. 1　Frequency distribution of SDR, VLR and VSR from the natural population

表2　主花序角果密度及其相關性狀表型間的相關性Table 2　Correlation of phenotype among SDR and its component traits in two years

圖2　213份甘藍型油菜的群體結構和親緣關系分析Fig. 2　Analysis of population structure and relative kinship in 213 B. napus

2.4　連鎖不平衡在A、C基因組中的衰減

對A基因組的10條染色體（A01—A10）和C基因組的9條染色體（C01—C09）分別繪制帶平滑線的LD衰減散點圖（圖3）。由圖3可以看出A和C基因組的 r2隨著遺傳距離的增加而下降，衰減距離也各不同。在r2的閾值為0.2標準下（表3），A基因組的平均衰減距離為450 kb，其中A08染色體的衰減速度最慢，衰減距離最大，約為1 350 kb；A02和A04染色體衰減速度最快，衰減距離約為200 kb。C基因組的平均衰減距離為950 kb，其中C02的衰減距離最大，約為1 400 kb；C07染色體的衰減距離最小，約為500 kb。A基因組的衰減距離整體比C基因組的衰減距離小得多。這可能與中國半冬性甘藍型油菜A基因組在育種中發生大規模重組，打破連鎖不平衡有關。

表3　連鎖不平衡在A、C基因組中的衰減距離Table 3　The Linkage disequilibrium attenuation decline in A and C genome

此外，A和C基因組中有些染色體在進入衰減距離后仍存在不同程度和數量的波峰（圖 3）。A基因組中的A06染色體在1 800 kb左右有明顯的峰，A01、A04、A05、A08和A10染色體在1 400—1 900 kb范圍內均出現了明顯且數量不同的峰。C基因組C07染色體在1 800和3 300 kb左右出現了明顯的峰，除C04、C05和C09染色體外的其他染色體也在不同的遺傳距離上出現了不同程度和數量的波峰。表明A和C基因組中同一條染色體上即使是距離較遠的2個標記之間，也可能存在一定的連鎖不平衡。

2.5　油菜主花序角果密度相關性狀的6種模型比較

從圖4可以看出，可能由于群體較小以及目標基因座與群體結構高度相關，除了2016年的主花序角果密度外，其他性狀的K、K+Q和K+PCA模型都表現出一定的假陰性。在 2015年的主花序角果密度（圖4-A）和2016年的主花序有效長（圖4-D）檢測到Q模型有效地控制了假陽性和假陰性結果的出現；2015年的主花序有效長（圖4-C）以PCA為最佳模型；2015和2016年的主花序有效角果數（圖4-E和圖4-F），MLM模型下的K、K+Q和K+PCA模型雖然表現為假陰性，但它們的P值較Q和GLM模型更接近期望值，因此，選用K+Q作為主花序有效角果數的最優模型；2016年的主花序角果密度（圖4-B）MLM模型下的K+Q和K+PCA模型均能較好地控制假陽性，但K+Q模型檢測到P值更接近期望值。

圖3　連鎖不平衡在A、C基因組不同染色體的衰減Fig. 3　The linkage disequilibrium decline in different chromosomes for A and C genome

2.6　全基因組關聯分析

GWAS分析2年數據共檢測到17個SNP位點與主花序角果密度及其相關性狀關聯（表4和圖5）。與主花序角果密度關聯的SNP標記位點有7個，其中2015年環境中，僅在 A03染色體上檢測出Bn-A03-p15240794與主花序角果密度關聯（圖5-A），P值為1.03×10-5，可解釋11.76%的表型變異；在2016年環境中，檢測到6個與主花序角果密度性狀相關的SNP位點（圖5-B），分布于染色體A01、A03、A04、A10和C01上，可解釋11.34%—15.96%的表型變異。與主花序有效長關聯的SNP標記位點共有9個，其中2015年環境中，在C03和C09染色體上各檢測出1個顯著關聯的SNP位點（圖5-C），可分別解釋10.67%和9.67%的表型變異；在2016年環境中，檢測到7個與主花序有效長相關的SNP位點（圖5-D），除C05染色體上檢測到1個位點，其他6個關聯位點都在C09染色體的6.5—6.8 M區域被檢測到，平均相距約50 kb，表型貢獻率在10%—13.10%；僅在2016年環境中，檢測到1個在A01染色體上與主花序有效角果數相關的SNP位點（圖5-F ）。

2.7　候選基因預測

基于甘藍型油菜參考基因組序列，對 LD區間的候選基因進行分析，篩選出了22個與主花序角果密度及其相關性狀有關的候選基因（表 5）。通過掃描與主花序角果密度顯著關聯SNP標記的LD區域，共篩選到12個重要候選基因；在與主花序有效長關聯SNP標記的LD區域內掃描到8個可能候選基因；在主花序有效角果數相關 LD區間篩選出 2個候選基因。其中，BnaA01g16940D、BnaC01g38800D和 BnaA04g09170D等主要通過調控赤霉素和生長素等內源激素的合成和信號轉導來控制主花序角果密度及其相關性狀，BnaA01g16970D、BnaA03g29180D、BnaA03g29810D、BnaC01g39680D和BnaC03g32770D通過對分生組織或花分生組織的調控來改變性狀表型，BnaC09g18690D和BnaC09g09210D等主要通過控制細胞分裂生長等過程改變性狀形態；而BnaA01g22310D在擬南芥中的同源基因 AT1G60420編碼 NRX1，具有典型的硫氧還蛋白（TRX）活性位點（WCG/PPC），在植物體內以二聚體的形式被發現，nrx1突變體表現花粉生育力減弱，導致最終角果數目顯著減少[32-33]。總之，這些基因主要與赤霉素和生長素等內源激素的合成和信號轉導、分生組織或花分生組織以及細胞分裂生長等過程有關，它們可能通過上述功能影響油菜花序或角果的發育，導致主花序角果密度及其相關性狀的表型變異。

圖4　6種統計模型對主花序角果密度及其相關性狀進行關聯分析的QQ圖Fig. 4　Quantile-quantile plots of estimated -Iog10(p) from association analysis using six models in SDR and its component traits

3　討論

角果密度是油菜理想株型的重要因素之一，其構成性狀（主花序長度和主花序有效角果數）是影響單株產量的重要因素，主要受多基因控制，遺傳率高[5-10]。本研究利用60 K SNP芯片對213份油菜的主花序角果密度及其相關性狀進行GWAS分析，兩年的主花序角果密度及其相關性狀的標記并沒有發現重復，且標記數目也相差較大，這可能是兩年環境差異較大引起的。本研究對主花序角果密度關聯分析發現，兩年都在A03染色體上檢測出顯著關聯的SNP，且標記之間相距4.4 Mb，說明在A03染色體上有控制主花序角果密度的主效基因；CHEN等[15]也在 A03染色體上檢測到與主花序角果密度關聯的 QTL。本研究兩年在 C09染色體上檢測到與主花序有效長顯著關聯位點成簇分布，與段秀建[60]在 C09上發現的位點相距約4.4 Mb，這表明在C09染色體上有控制主花序有效長的主效QTL。孫美玉[61]在兩年三環境中重復檢測到A01染色體上與主花序有效角果數相關的QTL，與該性狀連鎖的3個標記（GSSR134、BrSF162-9和BrSF49-32）距離較近，僅相距1 Mb左右，與本研究

發現的 Bn-Scaffold000582-p3247位點也是相距約 1 Mb，認為在 A01染色體的該區段內存在控制主花序有效角果數的主效QTL。

表4　兩年主花序角果密度及其相關性狀的顯著關聯標記Table 4　Significance association markers of SDR and its component traits in two years

表5　主花序角果密度及其相關性狀的候選基因Table 5　A summary of candidate genes associated with SDR and its component traits

圖5　2年主花序角果密度及其相關性狀的Manhattan圖Fig. 5　Manhattan plot of SDR and its component trait in two year

通過關聯分析，掃描與性狀顯著關聯SNP位點的 LD區域，借助擬南芥基因組數據庫，篩選到了22個與性狀相關的候選基因，其中包含多個位于關聯 SNP位點處或在位點附近的基因。這些基因部分與赤霉素和生長素等內源激素的合成和信號轉導、分生組織或花分生組織以及細胞分裂生長等過程有關。如BnaA01g16940D與擬南芥AT4G28160同源，在花序中表達，編碼的富含脯氨酸糖蛋白家族蛋白是細胞壁的組成成分，參與對赤霉素刺激的反應，誘導莖伸長和花發育，通過調控最終角果數目和花序長影響角果密度[33-34]；C01染色體的BnaC01g39480D與擬南芥的AT3G08510（ATPLC2）同源，編碼磷酸肌醇特異性磷脂酶C（PI-PLC）催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸水解成肌醇 1,4,5-三磷酸和二?；视?，參與生長素的生物合成和信號轉導，是雌配子發生和胚胎發育所必需的，雜合子plc2-2突變體有角果數較少和胚胎在球狀期前停滯與細胞分裂異常的表型[49-50]；BnaA01g16970D與擬南芥ULT1同源，編碼 B-box 結構域富含 Cys（半胱氨酸）蛋白，是分生組織細胞積累在花序和花分生組織的負調節器；ult1突變體使花序分生組織擴大，產生額外的花和花器官，并在花分生組織中表達降低[35-36]；A03染色體的BnaA03g29810D，在擬南芥中的同源基因AT3G07050編碼類核干細胞因子1（nucleostemin- like 1，NSN1），于花序分生組織和花原基中高水平表達，是維持花序分生組織和花器官發育所必需的；NSN1雜合和純合植株通過形成花冠花而終止花序發育，過表達導致頂端優勢喪失和缺陷花的形成[42-43]。雖然，基因與環境互作導致環境特異關聯SNP很難通過分子標記輔助選擇促進其他地區油菜增產，但通過基因工程手段對部分高產基因進行操作很可能實現其他地區油菜產量的提升，對中國油菜生產和發展具有重要意義。

4　結論

共檢測到17個SNP與主花序角果密度及其相關性狀關聯，其中與主花序角果密度關聯的標記有 7個，與主花序有效長關聯的標記有9個，與主花序有效角果數相關聯的標記僅有1個，這些SNP均為環境特異位點，表明其受基因與環境互作影響。LD區間內調節內源性激素的合成和轉導、植物細胞組織發生、花分生組織發育、角果數目和多器官發育基因BnaA01g16940D、BnaA03g29810D、BnaC01g39480D、BnaA01g16970D和 BnaC09g09210D等 22個候選基因，可能通過上述功能影響油菜花序或角果的發育，導致主花序角果密度及其相關性狀的差異。

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