直腸癌患者KRAS基因突變和臨床因素對術后預后的影響

楊冬陽　馬冬　劉婉薇　賴曉嶸　黎瑩　孟凡　李子俊　徐飛

廣東省人民醫院，廣東省醫學科學院腫瘤中心1胃腸腫瘤內科，2消化內科（廣州510080）

近年來大腸癌在我國的發病率與病死率呈快速上升趨勢，其中直腸癌發病年齡中位數在45歲左右。青年人發病率有升高的趨勢，需引起足夠的重視［1］，手術是主要的治療手段，但多數患者發現時已為中晚期，且晚期患者預后不佳，需探尋術后預后的影響因素，進一步指導治療、改善預后。

目前對直腸癌術后預后的影響因素仍在探索中。有研究報道，大腸癌的發病可能與表皮生長因子受體（EGFR）信號的激活有關。原癌基因KRAS作為EGFR下游信號通路中重要的分子［2］，已有臨床研究證實KRAS突變可以持續激活下游Raf/Erk/Map激酶和其他信號通路來促進腫瘤細胞的浸潤和轉移。但KRAS突變的方式對直腸癌患者預后進程的影響目前僅有有限的資料和數據［3-5］。故我院對130例行直腸腫瘤切除術后的直腸癌患者的KRAS基因突變與手術預后及其他病理學因素之間的關系進行5年隨訪的分析，為術后直腸癌患者的預后影響因素尋找依據。

1　對象與方法

1.1研究對象收集我院2010年1-12月確診直腸腺癌進行開腹或腹腔鏡下直腸腫瘤手術切除的直腸癌患者130例，患者需符合根據結直腸癌診療規范（2010年版）確診為直腸癌的患者；腫瘤病灶可行KRAS檢測；PS評分＜2；年齡≥18歲；性別不限。除外合并其他系統腫瘤；惡液質；妊娠或哺乳期婦女、育齡婦女拒絕接受避孕措施者；患者依從性差；預計生存期＜3個月。納入的130例患者中位年齡63歲，男92例，女38例。KRAS基因型：野生型85例，突變型45例；EGFR表達級別：EGFR?&+104例，EGFR++&+++26例；P53表達級別：P53?&+66例，P53++&+++64例；分化程度：低分化21例，中-高分化109例；TNM分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期34例，Ⅲ期52例，Ⅳ期21例；發生多發轉移：多發轉移8例，其他轉移13例和未轉移109例；發生肝轉移：肝轉移5例，其他轉移16例和未轉移109例；發生肺轉移：肺轉移4例，其他轉移17例和未轉移109例；淋巴結轉移：淋巴結轉移數≤3的104例，淋巴結轉移數＞3的26例；詳細情況見表1。直腸癌分期標準采用2009年修改的國際抗癌聯盟（UICC）和美國腫瘤聯合會（AJCC）聯合制定的TNM分期法。

1.2實驗方法

1.2.1實驗試劑與儀器DNA提取試劑；TE緩沖液；檢測基因型試劑盒：包含PCR反應、SAP反應、延伸反應等試劑；光學顯微照相系統；ABI Veriti梯度PCR儀；凝膠成像分析系統。

1.2.2標本采集及處理于腫瘤病灶上提取癌組織，癌組織在固定標本并脫水透明后，進一步浸蠟包埋及切片，制成組織切片進行蘇木精-伊紅染色（HE染色），組織學診斷由本院2位病理學專家完成。EGFR、P53免疫組化結果無陽性染色為陰性（-）；陽性細胞數少于10%為弱陽性（+）；10% ～50%為陽性（++）；＞50%為強陽性（+++）。

1.2.3DNA提取和擴增本研究采用Goelz氏DNA提取方法對石蠟包埋組織進行DNA提取模板DNA。KRAS基因突變的檢測方法采用目前公認的直接測序法［6］進行。NCBI基因數據庫作為引物的參照方，在設定好的PCR儀上進行擴增反應，PCR擴增產物電泳后，在凝膠成像儀下觀察記錄結果。

1.2.4基因測序將PCR擴增產物通過純化后，使用焦磷酸測序技術進行測序。

1.3統計學方法用SPSS 20.0軟件統計分析。Kaplan?Meier法對比直腸癌手術患者生存與臨床病理學因素關系。Log?rank檢驗分析作為顯著性檢驗，對影響直腸癌生存的各種要因進行探討。卡方檢驗法評價突變的KRAS基因與手術后患者臨床病理學因素之間的關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1基因分型KRAS為點突變，90%的KRAS基因突變位于2號外顯子的第12和13密碼子位點。入選的130例直腸癌患者中，共45例發生KRAS基因突變，突變率為34.6%，12密碼子和13密碼子有共同突變的頻率為0%。其中12密碼子突變和13密碼子突變的頻率分別為93.4%和6.6%。

2.2KRAS基因突變和直腸癌手術患者臨床病理學因素的關系KRAS基因突變與EGFR更強的陽性表達、腫瘤的多發轉移顯著相關（P＜0.05）；與手術患者的其他病理學因素如P53、TNM分期、腫瘤分化程度、性別、年齡、肝臟轉移、肺轉移和其他淋巴結轉移等臨床病理學因素差異均無統計學意義。見表1。

2.3直腸癌患者預后相關因素分析130例患者追蹤隨訪發現，至2016年1月，共71例患者生存，總的平均生存期為56.2個月，5年生存率為54.8%（圖1）。Kaplan?Meier法單因素分析結果（表2）顯示，野生型的KRAS基因患者手術后平均生存時間為57.5個月，突變型的KRAS基因患者手術后平均生存時間為58.9個月，差異無統計學意義（P＞0.05，圖2）。

其他臨床病理學因素與手術預后生存期關系如下：TNM分期與患者預后相關，Ⅰ期患者平均生存時間為65.0個月，Ⅱ期患者平均生存時間為59.7個月，Ⅲ期患者平均生存時間為56.4個月，Ⅳ期患者平均生存時間為49.0個月，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖3）。同時我們發現，癌細胞的轉移對直腸癌患者的手術預后具有顯著影響，Kaplan?Meier法單因素分析顯示多發轉移（P＜0.05，圖4）、肝轉移（P＜ 0.05，圖5）、肺轉移（P＜0.05，圖6）與直腸癌患者預后不良關系密切。

3　討論

KRAS基因不僅是細胞內信號轉導的因素，也在EGFR信號通路轉導中起重要作用。KRAS基因的突變可以誘導腫瘤細胞增殖、血管形成，誘導腫瘤細胞局部侵襲、遠處轉移，使正常EGFR信號通路的調控無法進行，KRAS基因突變在腸癌突變率為20%～60%［6］。有研究者認為，腸癌惡性腫瘤的KRAS基因突變具有預測預后的價值［7-12］，也有學者認為KRAS基因突變對腸癌預后并無影響［13-17］。

表2　直腸癌患者預后影響因素的Kaplan?Meier法單因素分析Tab.2　Kaplan?Meier analysis method of the single factor effect of patients with rectal cancer prognostic factors

本研究提示130例直腸癌術后患者KRAS突變率為34.6%，現階段國際報道KRSA突變率為30% ～ 35%［8］，較常見第12位密碼子突變［18］，提示中國直腸癌患者KRAS基因突變率和國際的類似。χ2檢驗提示KRAS基因突變與EGFR更強的陽性表達及直腸癌多發轉移有關，發現直腸癌的多發轉移和KRAS突變有關系，提示患者EGFR高表達和患者多發轉移發生KRAS突變的幾率更高。KRAS基因突變與其他病理學因素如P53表達、TNM分期、分化程度、淋巴結轉移、性別、年齡等無相關。

圖1　130例直腸癌患者的總體生存曲線　圖2　KRAS不同基因型患者的總體生存曲線　圖3　不同分期直腸癌患者總體生存曲線Fig.1　130 overall survival curves of with different genotypes　Fig.2　The overall survival curves of KRAS patients patients with rectal cancer　Fig.3　The overall survival curves of different Stages of colorectal cancer patients

圖4　是否有多發轉移直腸癌患者的總體生存曲線　圖5　是否有肝轉移的直腸癌患者總體生存曲線　圖6　是否有肺轉移的直腸癌患者總體生存曲線Fig.4　The overall survival curve of patients with multiple metastatic colorectal cancer　Fig.5　Whether patients with rectal cancer survival curve of liver metastasis　Fig.6　Whether patients with rectal cancer survival curve of lung metastasis

進一步單變量統計分析提示野生型KRAS基因患者的預后對比突變型KRAS基因患者的預后，兩者的總體生存無明顯差異。一個腸癌的研究［13］中認為KRAS基因突變并不對腸癌患者預后有預測價值，其他KRAS基因突變的回顧性臨床研究［14-17］也得出了相似的結論。但是目前的主流觀點［7-12］仍然是KRAS基因突變對腸癌患者的預后存在一定的影響。

然而，目前學術界對上述兩種不同的觀點的爭論存在另外一種看法，有學者認為，KRAS基因突變率的檢測率易受到環境因素、檢測方法的特異性和敏感性、樣本量的多少等的影響［19］，這些因素都會影響KRAS基因突變率的最終結果。本研究認為可能與以下原因有關：研究群體的異質性，如早期病例的研究人群較少；KRAS基因突變的檢測方法的局限性，KRAS野生型患者用直接測序法進行檢測易獲得假陰性結果；KRAS突變的量（突變豐度）的不同對患者的預后產生影響［20］，在低靈敏度的方法檢測下，突變豐度低的患者被檢測為野生型，導致結果的不準確。

另外，2013年的歐洲癌癥大會上德國腫瘤醫學協會合作調查小組認為，僅僅檢測KRAS基因的突變是不足以用于進行腸癌患者的關鍵治療策略的抉擇的。目前，最新的進展認為，進行KRAS、BRAF、NRAS的全面檢測，對判斷治療及對預后的影響分析是更有益的［21］，受限于2010年的檢測手段，當時檢測選擇僅限KRAS。

進一步分析發現我們的研究群體主要是行腫瘤切除手術后的患者，與既往大部分的研究有比較大的區別，該群體的身體狀況、耐受性、可預期壽命可能更長，故患者的存活時間均比較長。尤其對于晚期患者，我們發現這類患者在進行直腸癌手術治療后，總體的生存期得到較好的體現，提示晚期患者能進行直腸癌的手術治療可能的獲益及預后的判斷，也有研究認為，在提高患者生存率及生存時間上，行腫瘤切除手術往往比單純化療更有效［9］。進一步分析患者的其他病理學因素與手術預后的關系發現，腫瘤TNM分期和腫瘤的轉移部位多發轉移、肝轉移、肺轉移與直腸癌患者預后不良關系密切。

綜上所述，KRAS基因突變與EGFR更強的陽性表達和腫瘤的多發轉移有關，TNM高分期，轉移部位影響手術預后，Ⅳ期患者直腸癌手術切除后有提高生存趨勢，KRAS基因突變對于直腸癌患者手術預后的關系尚不明確，我們須進一步擴大樣本量，改進KRAS基因突變的檢測方法，使用合適的方法進行全RAS的檢測，進一步進行研究。

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