ROC曲線分析miRNA-221/222作為侵襲性甲狀腺乳頭狀癌診斷標志物的臨床價值△

林在楷，周琨，陸霽，董冰，韓肖驊，馬保金，孫強

上海市靜安區中心醫院（上海復旦大學附屬華山醫院靜安分院）普外科，上海2000400

甲狀腺癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤，其發病率呈逐年上升趨勢，組織學可將其分為濾泡細胞癌和濾泡旁細胞癌。濾泡細胞癌又分為乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）、濾泡狀癌、未分化癌和髓樣癌四類[1]。PTC是甲狀腺癌中最常見的亞型，占內分泌系統惡性腫瘤的70%～80%[2]。研究發現，PTC的發生、發展不僅與基因的重排/突變有關，也與微小RNA（microRNA，miRNA）的調控密切相關[3]。miRNA靶向目標基因調控不同亞型甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲成為近年研究的熱點。迄今為止，只有少數的miRNA被證明與分化型甲狀腺癌相關，其中，包括上調的miRNA‐146b‐5p、miRNA‐21、miRNA‐2861、miRNA‐221/222、miRNA‐451以及下調的miRNA‐16、miRNA‐613等[4]。但是，關于miR‐NA與甲狀腺乳頭狀癌浸潤進展的相關性卻鮮有報道。因此，本研究通過檢測87例PTC患者腫瘤組織中miRNA‐221/222的表達水平，并結合PTC患者的臨床病理特征，評估miRNA‐221/222在甲狀腺乳頭狀癌診斷和判斷是否腺外浸潤中的應用價值，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2010年1月至2016年12月首診于上海市靜安區中心醫院普外科的PTC患者87例，組織病理類型的判斷標準參照2007版美國癌癥聯合委員會（American Joint Committeeon Cancer，AJCC）甲狀腺腫瘤的病理學分類。PTC納入標準：①腺外浸潤（invasion‐PTC，Ⅰ‐PTC），腫瘤浸潤、突破包膜或伴有淋巴管、氣道、食管、頸前肌群侵犯；②腺內浸潤（localization‐PTC，L‐PTC），腫瘤局限包膜內、單發不伴淋巴結轉移和鄰近器官受累。結節性甲狀腺腫（mutinodular goiter，MNG）納入標準：組織病理學檢查證實；病灶呈單發或多發；伴或不伴包膜浸潤；局部淋巴細胞增生。PTC患者排除標準：①放射性物質接觸者；②合并甲狀腺功能異常、甲狀腺炎、結節性甲狀腺腫及甲狀腺腺瘤疾病者；③既往有甲狀腺惡性腫瘤手術史；④合并其他系統惡性腫瘤、傳染病及內科慢性病者。MNG排除標準同上，外加術中冰凍證實合并甲狀腺癌者。臨床病理資料中，47例患者經病理檢查確診為腫瘤侵出甲狀腺包膜外，侵犯甲狀腺鄰近組織或器官，為腺外浸潤；40例患者腫瘤局限于包膜內，無腺外浸潤。再選取同期27例MNG患者和18例正常甲狀腺（normal thyroid，NT）患者的甲狀腺組織，其中，18例NT患者的甲狀腺組織由病理科提供，系咽喉部腫瘤手術切除的正常甲狀腺組織。PTC患者中，男35例，女52例；年齡為16～74歲，平均（46.37±10.88）歲；MNG組中，男8例，女19例；年齡為19～52歲，平均（43.24±6.94）歲；NT組中，男5例，女13例；年齡為39～77歲，平均（50.12±11.07）歲。按照隨機化、對照分組原則，將研究對象分為4組。本研究經醫院倫理委員會審批通過。

1.2 標本處置

留取新鮮標本組織腫瘤外2.5 cm處正常甲狀腺組織1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm，在保證病理取材需要后，留取待測含包膜癌組織1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm，置標本于無RNase的凍存管并密封保存于液氮中，取材全程無菌操作。病理切片由兩位病理學教授獨立閱片。

1.3 熒光定量PCR分析檢測

標本總RNA抽提參照miRcute miRNA提取分離試劑盒（購自上海生物科技有限公司）步驟進行。引物序列miRNA‐221上游引物為5'‐CGAGACTGT‐GAGAATTACTTGCAAGCTG‐3'，下游引物為5'‐CC‐GCTCGAGCATTGGTGAGACAGCCAATG‐3'；miR‐NA‐222上游引物為5'‐CGCAGATCTTTT‐CTTCCA‐CAGA‐3'，下游引物為 5'‐GGGGAT‐CCTCTCAG‐GACACT‐GAAGC‐3'；U6上游引物為5'‐CTC‐GCTTCGGCAGCACA‐3'，下游引物為5'‐AAA‐AATATGGAACGCTTCACGAA‐3'。引物序列經Genebank驗證。去除基因組DNA，將總RNA反轉錄為互補DNA（cDNA），再經實時熒光定量PCR檢測方法（quantitative real‐time PCR，qRT‐PCR）特異性擴增，獲單一熔解曲線峰，軟件分析得到Ct值（PCR反應中熒光信號達到設定閾值時的循環次數）。

1.4 統計學方法

應用SPSS 13.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK‐q檢驗，非正態分布的計量資料采用秩和檢驗。以2‐ΔΔCt標準化miR‐NA表達數據構建ROC曲線，分別計算miRNA‐221和miRNA‐222在診斷甲狀腺乳頭狀癌和判斷是否腺外浸潤中的特異度和靈敏度。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同甲狀腺組織中miRNA-221/222表達情況的比較

4組患者甲狀腺組織中miRNA‐221/222表達情況比較，差異有統計學意義（F=200.024、167.939，P＜0.01）。兩兩比較可以看出，MNG組與NT組miR‐NA‐221/222的表達情況比較，差異無統計學意義（P＞0.05），其余任意兩組間的miRNA‐221/222表達情況比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。miRNA‐221和miRNA‐222在PTC中表達上調，高于MNG組和NT組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同甲狀腺組織中miRNA‐221/222表達情況的比較（ 2‐ΔΔCt）

2.2 miRNA-221/222表達與PTC患者臨床病理特征的關系

有淋巴結轉移和（或）腺外浸潤患者miRNA‐221/222的表達高于無淋巴結轉移和（或）無腺外浸潤患者，差異有統計學意義（P＜0.05），而不同性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤分期及是否為多灶性腫瘤患者miRNA‐221/222的表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 miRNA‐221/222表達與PTC患者臨床病理特征的關系（ 2‐ΔΔCt）

2.3 miRNA-221/222表達的ROC分析

以miRNA‐221/222的表達水平診斷甲狀腺腫瘤良惡性（圖1A），miRNA‐221的曲線下面積（area un‐der curve，AUC）為 0.803（95%CⅠ：0.735～0.871），miRNA‐222的AUC為0.802（95%CⅠ：0.737～0.868）。miRNA‐221的截斷值為0.487時，診斷靈敏度為80.7%，特異度為74.8%；miRNA‐222的截斷值為0.502時，診斷靈敏度為78.3%，特異度為73.2%。以miRNA‐221/222的表達水平診斷甲狀腺腫瘤侵襲性（圖1B），miRNA‐221的 AUC為 0.660（95%CⅠ：0.524～0.797），miRNA‐222的AUC為0.653（95%CⅠ：0.512～0.794）。miRNA‐221的截斷值為 0.846時，診斷靈敏度為63.6%，特異度為52.5%；miRNA‐222的截斷值為0.851時，診斷靈敏度為63.6%，特異度為73.8%。

圖1 miRNA‐221/222表達的ROC分析

3 討論

本研究通過總結大量的甲狀腺癌手術發現，高度侵襲性PTC常侵犯氣管、食管，甚至包繞喉返神經。雖然術前超聲、CT及細針穿刺可以為診斷提供幫助，但在甲狀腺腫瘤是否存在腺外浸潤、是否有轉移及預后預判上仍存在一定困難。

近年關于miRNA的研究發現，在甲狀腺癌中，多種miRNA表達上調，如miRNA‐146b、miRNA‐222、miRNA‐221、miRNA‐10b、miRNA‐187等；一些miR‐NA 表達下調，如 miRNA‐199a、miRNA‐204、miR‐NA‐218、miRNA‐300等[5‐6]。利用這些分子病理學的改變，使得甲狀腺癌的早期診斷和侵襲性有望更快實現。本研究得到類似結果，miRNA‐221和miRNA‐222在PTC中表達上調，高于MNG組和NT組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

有學者構建BRAF基因突變小鼠模型發現，PTC進展到低分化癌[7]。最新研究發現，miRNA‐126可靶向抑制BRAF突變的未分化甲狀腺癌細胞增殖[8‐10]，提示PTC發展是一個動態變化的過程，其進展時腫瘤直徑增大，腺外侵襲增強，甲狀腺乳頭狀癌隨著腫瘤細胞的增殖，其侵襲性增強，可逐步進展為低分化甲狀腺癌[11‐12]。因此，高度侵襲性PTC是否因BRAF基因融合了PI3KR2基因突變而致分化程度降低，呈現為惡性程度激增，有待進一步深入研究。值得注意的是，本研究發現，存在腺外浸潤的PTC患者組織中miRNA‐221/222的表達水平高于無腺外浸潤的PTC患者，差異有統計學意義（P＜0.05），提示侵襲性PTC與局限性PTC在分子病理上可能有更多差異，而miRNA‐221/222有望成為判斷PTC是否腺外浸潤的生物標志物。

研究顯示，miRNA‐221和miRNA‐222可能通過下調MMP抑制劑增強癌細胞的轉移能力[13‐14]。有研究表明，miRNA‐221可抑制細胞周期依賴性蛋白p27kip1的表達，p27Kip1在G1/S細胞周期的負性調控中具有關鍵作用，強制表達miRNA‐221和miRNA‐222可以刺激甲狀腺癌細胞打破G1/S周期停滯，從而持續增殖[15‐16]。本研究結果顯示，有淋巴結轉移和腺外浸潤的PTC患者miRNA‐221/222的表達高于無淋巴結轉移和無腺外浸潤患者，差異有統計學意義（P＜0.05），提示PTC患者腺外浸潤和淋巴結轉移可能與miRNA‐221/222表達上調有關。

本研究以miRNA‐221/222的表達水平診斷甲狀腺腫瘤良惡性的效果較好，其AUC分別為0.803和0.802。Zhu等[17]研究指出，miRNA‐221通過抑制PTEN和TⅠMP3的表達，最終導致癌細胞侵襲和轉移。ROC曲線結果顯示，miRNA‐221的截斷值為0.846時，判斷PTC侵襲性的診斷靈敏度為63.6%，特異度為52.5%；miRNA‐222的截斷值為0.851時，診斷靈敏度為63.6%，特異度為73.8%，提示miR‐NA‐221/222在判斷甲狀腺癌侵襲性方面有一定的價值，但靈敏度和特異度還不夠。因此，研究認為，后續研究可嘗試引入更多相關的miRNA進行聯合診斷，以達到臨床應用的標準。

綜上所述，miRNA‐221/222在PTC患者組織中表達上調，與PTC侵襲程度和淋巴結轉移情況相關，支持其作為侵襲性PTC潛在的生物標志物，但利用特異度miRNA判斷甲狀腺癌的侵襲、轉移風險性，仍有待進一步深入研究。

[1]Liu R,Xing M.TERT promoter mutations in thyroid cancer[J].Endocrine‐related Cancer,2016,23(3):R143.

[2]Zhang KE,Ge SJ,Lin XY,et al.Ⅰntercellular adhesion mol‐ecule 1 is a sensitive and diagnostically useful immunohis‐tochemical marker of papillary thyroid cancer(PTC)and of PTC‐like nuclear alterations in Hashimoto’s thyroiditis[J].Oncol Lett,2016,11(3):1722‐1730.

[3]Mayr C,Wagner A,Loeffelberger M,et al.The BMⅠ1 inhib‐itor PTC‐209 is a potential compound to halt cellular growth in biliary tract cancer cells[J].Oncotarget,2016,7(1):745‐758.

[4]Zhao Y,Lin J,Xu B,et al.MicroRNA‐mediated repression of nonsense mRNAs[J].Elife,2014,3(4):e03032.

[5]Huang CT,Oyang YJ,Huang HC,et al.MicroRNA‐mediat‐ed networks underlie immune response regulation in papil‐lary thyroid carcinoma[J].Sci Rep,2014,4(9):6495.

[6]Dimri M,Kang M,Dimri GP.A miR‐200c/141‐BMⅠ1 auto‐regulatory loop regulates oncogenic activity of BMⅠ1 in cancer cells[J].Oncotarget,2016,7(24):36220‐36234.

[7]Dagmara R,Michal S,Ewa C,et al.BRAFV600E‐Associat‐ed Gene Expression Profile:Early Changes in the Transcrip‐tome,Based on a Transgenic Mouse Model of Papillary Thyroid Carcinoma[J].PLoS One,2015,10(12):e0143688.

[8]Danysh BP,Rieger EY,Sinha DK,et al.Long‐term vemu‐rafenibtreatmentdrivesinhibitorresistancethroughasponta‐neous KRAS G12D mutation in a BRAF V600E papillary thyroid carcinomamodel[J].Oncotarget,2016,7(21):30907‐30923.

[9]Wixted JH,Rothstein JL,Eisenlohr LC.Ⅰdentification of functionally distinct TRAF proinflammatory and phosphati‐dylinositol 3‐kinase/mitogen‐activated protein kinase/extra‐cellular signal‐regulated kinase kinase(PⅠ3K/MEK)trans‐forming activities emanating from RET/PTC fusion oncop‐rotein[J].J Biol Chem,2012,287(6):3691‐3703.

[10]Xiao J,Lin HY,Zhu YY,et al.MiR‐126 regulates prolifer‐ation and invasion in the bladder cancer BLS cell line by targeting the PⅠK3R2‐mediated PⅠ3K/Akt signaling path‐way[J].Oncol Targets Ther,2016,9:5181‐5193.

[11]Duquette M,Sadow PM,Husain A,et al.Metastasis‐asso‐ciated MCL1 and P16 copy number alterations dictate re‐sistance to vemurafenib in a BRAFV600E patient‐derived papillary thyroid carcinoma preclinical model[J].Oncotar‐get,2015,6(40):42445‐42467.

[12]Dagmara R,Michal S,Ewa C,et al.BRAFV600E‐associ‐ated gene expression profile:early changes in the tran‐scriptome,based on a transgenic mouse model of papil‐lary thyroid carcinoma[J].PLoS One,2015,10(12):e0143688.

[13]Li L,Li H.Role of microRNA‐mediated MMP regulation in the treatment and diagnosis of malignant tumors[J].Cancer Biol Ther,2013,14(9):796‐805.

[14]Xu Q,Li P,Chen X,et al.MiR‐221/222 induces pancreat‐ic cancer progression through the regulation of matrix me‐talloproteinases[J].Oncotarget,2015,6(16):14153‐14164.

[15]Galardi S,Mercatelli N,Farace MG,et al.NF‐kB and c‐Jun induce the expression of the oncogenic miR‐221 and miR‐222 in prostate carcinoma and glioblastoma cells[J].Nucleic Acids Res,2011,39(9):3892‐3902.

[16]Galardi S,Petretich M,Pinna G,et al.CPEB1 restrains proliferation of Glioblastoma cells through the regulation of p27(Kip1)mRNA translation[J].Sci Rep,2016,6:25219.

[17]Zhu J,Liu F,Wu Q,et al.MiR‐221 increases osteosarco‐ma cell proliferation,invasion and migration partly through the downregulation of PTEN[J].Ⅰnt J Mol Med,2015,36(5):1377‐1383.