Nanog、Sox 2、TFF 3在腸型胃癌中的表達(dá)及其與腸型胃癌預(yù)后關(guān)系的研究△

張詠梅，范麗昕，蔡永清，樸正愛，王海，周易，董華承，李萍

大連市第三人民醫(yī)院腫瘤科，遼寧 大連1160300

胃癌作為常見的惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率不盡相同，中國是胃癌高發(fā)地區(qū)之一。中國每年新發(fā)惡性腫瘤中，胃癌排名第2位，在消化道腫瘤中排名第1位。Lauren分型于1965年由Lau‐ren提出，2009年TOGA研究奠定了晚期胃癌的新型靶向治療，在此研究中發(fā)現(xiàn)Lauren分型與人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的表達(dá)有明顯的相關(guān)性，從而使Lauren分型再次受到臨床醫(yī)師的高度重視。Lau‐ren分型中腸型胃癌占大部分，但由于胃癌具有非常明顯的異質(zhì)性，Lauren分型無法區(qū)分不同生物學(xué)行為的腸型胃癌，減弱了其對預(yù)后的指導(dǎo)作用。因此，尋找腸型胃癌的預(yù)后生物標(biāo)志物一直是腫瘤學(xué)研究的熱點。而聯(lián)合檢測多個生物標(biāo)志物能更準(zhǔn)確地判斷預(yù)后，有利于更好地評估腸型胃癌的生物學(xué)行為，對臨床治療方案的選擇具有重要意義。

腸型胃癌的發(fā)生是循序漸進(jìn)的，被認(rèn)為是由一系列癌前病變發(fā)展而來的，即Correa[1]提出的慢性淺表性胃炎→慢性萎縮性胃炎→腸化生→不典型增生→黏膜內(nèi)癌→侵襲性癌的轉(zhuǎn)化過程。Nanog、Sox2參與了腸上皮化生向腸型胃癌發(fā)生發(fā)展的過程。三葉因子3（trefoil factor 3，TFF3）在Correa級聯(lián)反應(yīng)的各個階段表現(xiàn)不同。本研究通過檢測腸型胃癌患者術(shù)后Nanog、Sox2、TFF3的表達(dá)情況，評價其表達(dá)情況與腸型胃癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2009年1月至2010年12月于大連市第三人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的腸型胃癌標(biāo)本60例。60例腸型胃癌患者的年齡為39～86歲，平均（63.13±9.43）歲；男43例，女17例。所有患者術(shù)前均未行放化療，TNM分期采用2010年美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）分期標(biāo)準(zhǔn)。病灶位于賁門13例，位于胃體竇部47例；侵犯深度T1期8例，T2期9例，T3期26例，T4期17例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0期14例，N1～3期46例；TNM分期Ⅰ期11例，Ⅱ期18例，Ⅲ期26例，Ⅳ期5例。所有患者均進(jìn)行電話隨訪或門診隨訪。總生存期為患者確診時至死亡或末次隨訪時間，無病生存期為患者確診時至疾病進(jìn)展或末次隨訪時間。末次隨訪時間為2015年12月30日。

1.2 標(biāo)本處理

所有標(biāo)本均應(yīng)用10%中性福爾馬林固定，并進(jìn)行常規(guī)脫水，石蠟包埋及切片，片厚4～5 μm。

1.3 試劑和方法

兔抗人Nanog單克隆抗體、兔抗人Sox2單克隆抗體、鼠抗人TFF3單克隆抗體均購自Abcam公司；一抗試劑稀釋濃度：Nanog 1/100，Sox2 1/100，TFF3 1/100。一抗試劑盒、二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自福建邁新生物技術(shù)有限公司。用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH值為7.4）代替一抗作為陰性對照，用已知陽性片作為陽性對照。免疫組化染色采用SP法，染色步驟按說明書進(jìn)行。

1.4 免疫組化染色判定方法

細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕黃色顆粒為陽性。每張切片隨機觀察5個高倍視野（400倍）。細(xì)胞染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞所占百分比評分：陽性細(xì)胞所占百分比＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。采用半定量積分法判定結(jié)果，即將染色強度與陽性細(xì)胞所占百分比計分的乘積定為每1例染色的綜合評分，0～2分為（－），3～5分為（+），6～9分為（++），10～12分為（+++）。評分≤2分為低表達(dá)，評分＞2分為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan‐Meier法進(jìn)行生存曲線分析，組間比較采用Log‐rank檢驗。采用Cox比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行多因素分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nanog、Sox 2、TFF 3在腸型胃癌中的表達(dá)

60例腸型胃癌患者的Nanog、Sox2主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，TFF3主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。Nanog高表達(dá)者 38例（63.3%），TFF3高表達(dá)者 33例（55.0%），Sox2低表達(dá)者35例（58.3%）。（圖1）

圖1 腸型胃癌患者的Nanog、Sox 2、TFF 3免疫組化圖片（SP染色，×400）

2.2 Nanog、Sox 2、TFF 3的表達(dá)情況與腸型胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

單因素分析結(jié)果顯示，Nanog、TFF3、Sox2的表達(dá)情況與腸型胃癌患者的腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期有關(guān)（P＜0.05），與腸型胃癌患者的年齡、性別、腫瘤部位無關(guān)（P＞0.05）。（表1）

2.3 Nanog、Sox 2、TFF 3的表達(dá)情況與腸型胃癌患者無病生存期和總生存期的關(guān)系

Nanog低表達(dá)腸型胃癌患者的無病生存期和總生存期長于Nanog高表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Sox2高表達(dá)腸型胃癌患者的無病生存期和總生存期長于Sox2低表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。TFF3低表達(dá)腸型胃癌患者的無病生存期和總生存期長于TFF3高表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（圖2、圖3）。

2.4 Nanog、Sox 2、TFF 3聯(lián)合表達(dá)與腸型胃癌患者無病生存期和總生存期的關(guān)系

多因素分析結(jié)果顯示，同時具有Nanog低表達(dá)、TFF3低表達(dá)、Sox2高表達(dá)的腸型胃癌患者預(yù)后最佳，同時具有Nanog高表達(dá)、TFF3高表達(dá)、Sox2低表達(dá)的腸型胃癌患者預(yù)后最差。（表2、表3）

3 討論

隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的提出，如何將遺傳學(xué)信息用于指導(dǎo)診斷或治療備受關(guān)注。由于胃癌具有非常明顯的異質(zhì)性，相同臨床分期的腸型胃癌存在明顯不同的預(yù)后狀態(tài)，使得根據(jù)臨床分期進(jìn)行治療存在很多不足。因此尋找與患者預(yù)后生存相關(guān)的分子標(biāo)志物，對腸型胃癌更細(xì)致的分型、預(yù)后判斷、隨訪以及潛在改變腸型胃癌患者的治療方式并提出個體化的診療具有重要意義。

表1 Nanog、Sox 2、TFF 3的表達(dá)情況與腸型胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

3.1 Nanog在腸型胃癌組織中的表達(dá)

Nanog為ANTP類NK家族基因，定位于人染色體12p13區(qū)，作為胚胎干細(xì)胞維持其多潛能性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在乳腺癌、精原細(xì)胞瘤、腸癌、宮頸癌等多種腫瘤中高表達(dá)，且與這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[2‐5]。本研究結(jié)果顯示，Nanog的表達(dá)情況與腸型胃癌患者的腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期有關(guān)（P＜0.05），腫瘤浸潤深度越深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期越晚，Nanog表達(dá)水平越高。而腫瘤浸潤深度深、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移、TNM分期晚皆為腫瘤的惡性表型，提示Nanog可能在腸型胃癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定的作用。說明Nanog可以作為判斷腸型胃癌預(yù)后的指標(biāo)。

3.2 TFF 3在腸型胃癌組織中的表達(dá)

TFF3屬于三葉因子家族，是由胃腸道黏液分泌上皮合成和分泌的一組具有特定三葉結(jié)構(gòu)的小分子多肽，主要功能是維持胃腸道黏膜的完整性和促進(jìn)上皮修復(fù)，此外還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞信號傳導(dǎo)和細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤侵襲的功能[6]。本研究結(jié)果顯示，在腸型胃癌組織標(biāo)本中，TFF3的表達(dá)情況與腸型胃癌患者的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（P＜0.05），而與患者的年齡、性別、腫瘤部位無關(guān)（P＞0.05）。TFF3高表達(dá)腸型胃癌患者的無病生存期和總生存期短于TFF3低表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明TFF3可以作為預(yù)測腸型胃癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。

3.3 Sox 2在腸型胃癌組織中的表達(dá)

圖2 Nanog、Sox 2、TFF 3高表達(dá)與低表達(dá)腸型胃癌患者的無病生存曲線

圖3 Nanog、Sox 2、TFF 3高表達(dá)與低表達(dá)腸型胃癌患者的生存曲線

Sox2是Sox家族成員之一，位于3號染色體q26.3‐q27[7]。通過HMG結(jié)構(gòu)域識別靶基因，特異性結(jié)合DNA序列，廣泛參與調(diào)控胚胎發(fā)育，尤其是在維持胚胎干細(xì)胞的自我更新能力和多能性上具有重要作用。它可能通過ⅠL‐4/STAR6信號通路維持胃細(xì)胞分化的方向，使細(xì)胞分化成腸化生細(xì)胞。本研究結(jié)果表明，在腸型胃癌中，腫瘤惡性程度越高，Sox2表達(dá)水平越低；Sox2高表達(dá)患者的無病生存期和總生存期長于Sox2低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其機制可能是Sox2可抑制胎盤特異蛋白1的表達(dá)，使細(xì)胞的運動能力、遷移能力和侵襲能力降低，細(xì)胞周期阻滯在G1～S期，降低細(xì)胞的增殖能力，在胃癌中起到一定的抑制腫瘤生長的作用。推測Sox2蛋白表達(dá)下降或缺失時，胃癌細(xì)胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移能力增強，可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的擴散和轉(zhuǎn)移[8]。

表2 腸型胃癌患者Nanog、Sox 2、TFF 3聯(lián)合表達(dá)的無病生存期分析

表3 腸型胃癌患者Nanog、Sox 2、TFF 3聯(lián)合表達(dá)的總生存期分析

3.4 腸型胃癌組織中Nanog、Sox 2、TFF 3的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

腸型胃癌與癌前病變有關(guān)，Nanog、Sox2、TFF3參與了腸上皮化生向腸型胃癌發(fā)生發(fā)展的過程。本研究進(jìn)一步分析Nanog、Sox2、TFF3聯(lián)合表達(dá)與腸型胃癌的關(guān)系。結(jié)果顯示，同時具有Nanog低表達(dá)、TFF3低表達(dá)、Sox2高表達(dá)的腸型胃癌患者預(yù)后最佳，同時具有Nanog高表達(dá)、TFF3高表達(dá)、Sox2低表達(dá)的腸型胃癌患者預(yù)后最差。提示聯(lián)合檢測Nanog、Sox2、TFF3在腸型胃癌中的表達(dá)較單一指標(biāo)更能夠準(zhǔn)確地判斷預(yù)后，有利于更好地評估腸型胃癌的生物學(xué)行為。

綜上所述，Nanog、Sox2、TFF3可以作為腸型胃癌患者獨立的預(yù)后生物標(biāo)志物，聯(lián)合檢測更利于判斷腸型胃癌患者預(yù)后，可以更好地為腸型胃癌的預(yù)后評估及臨床治療提供依據(jù)。

[1]Correa P.A human model of gastric carcinogenesis[J].Can‐cer Res,1988,48(13):3554‐3560.

[2]Ezeh UⅠ,Turek PJ,Reijo RA,et al.Human embryonic stem cell genes OCT4,NANOG,STELLAR,and GDF3 are ex‐pressed in both seminoma and breast carcinoma[J].Cancer,2005,104(10):2255‐2265.

[3]Meng HM,Zheng P,Wang XY,et al.Overexpression of Nanog predicts tumor progression and poor prognosis in colorectal cancer[J].Cancer Biol Ther,2010,9(4):295‐302.

[4]Ye F,Zhou C,Cheng Q,et al.Stem‐cell‐abundant proteins Nanog,Nucleostemin and Musashi1 are highly expressed in malignant cervical epithelial cells[J].BMC Cancer,2008,8:108‐112.

[5]Chiou SH,Yu CC,Huang GY,et al.Positive correlations of Oct‐4 and Nanog in oral cancer stem‐like cells and high‐grade oral squamous cell carcinoma[J].Clin Cancer Res,2008,14(13):4085‐4095.

[6]Babyatsky M,Lin J,Yio X,et al.Trefoil factor‐3 expres‐sion in human colon cancer liver metastasis[J].Clin Exp Metastasis,2009,26(2):143‐151.

[7]Maier S,Wilbertz T,Braun M,et al.SOX2 amplification is a common event in squamous cell carcinomas of different organ sites[J].Hum Pathol,2011,42(8):1078‐1088.

[8]Otsubo T,Akiyama Y,Hashimoto Y,et al.MicroRNA‐126 inhibits SOX2 expression and contributes to gastric carcino‐genesis[J].PLoS One,2011,6(1):e16617.