螺旋霉素高產菌株的選育

李春玲，丁亞蓮，謝文靜，牛 春，張 萍

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川 750101)

螺旋霉素(Spiramycin，SPM)是一種16元大環內酯類廣譜抗生素，主要由螺旋霉素鏈霉菌(Streptomycesspiramyceticus)發酵產生，用于治療革蘭氏陽性菌、部分革蘭氏陰性菌、立克次氏體及大型病毒所引起的耳、鼻、喉和呼吸道感染，對青霉素、新霉素、四環素、鏈霉素等的耐受菌也具有顯著的抑制作用。螺旋霉素在體內分布廣泛且組織細胞內濃度較高，不良反應和毒副作用明顯低于紅霉素等，在國內外用途極其廣泛，市場前景十分廣闊[1-3]。經過多年的研究，目前國內螺旋霉素發酵生產水平處于4000 μg/mL左右，不足國外生產水平的1/2，菌種的生產性能是主要制約因素之一。因此，為了提高國內螺旋霉素生產的競爭力，必須對生產菌種進行選育。螺旋霉素生產菌種選育主要是利用物理、化學等因素誘導菌種產生突變，獲得突變菌株，從中篩選出穩定、高產的優良菌株[4-7]。酰基激酶和酰基CoA合成酶是螺旋霉素內酯環生物合成的關鍵酶，而Co2+對酰基激酶和酰基CoA合成酶有較強的激活作用，通過選育耐受高濃度Co2+的突變株，可顯著增加酰基激酶和酰基CoA合成酶活力，進而提高螺旋霉素生產水平[8-9]。本研究利用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變、紫外線(UV)誘變和亞硝基胍(NTG)誘變的方法，結合螺旋霉素發酵生產過程的調控機制，定向選育出具有Co2+、豆油耐受性、噬菌體抗性的高產穩定性菌株，以期為進一步提高螺旋霉素的生產效率和產品品質奠定一定基礎。

1　材料與方法

1.1材料出發菌株為螺旋霉素鏈霉菌SPM-14078菌株，由寧夏泰瑞制藥股份有限公司技術中心保存。試劑均為國產分析純；恒溫大幅振蕩搖床(HQL150C，武漢科學儀器廠)、恒溫培養箱(LHP160，江蘇杰瑞爾電器有限公司)、ARTP常壓室溫等離子體生物育種機(ARTP-Ⅱ型，北京思清源生物科技有限公司)，分光光度計(BECKMANDU-600)、高效液相色譜系統(Waters)。

1.2培養基及培養條件斜面/分離培養基: 含葡萄糖、黃豆餅粉、CaCO3、MgSO4、NaCl、玉米漿、瓊脂，純水配制成1000 mL，pH調為6.9，121 ℃滅菌15 min，溫度28 ℃，相對濕度40%，培養7 d。

種子培養基：精糊、黃豆餅粉、NaCl、KH2PO4、玉米漿、CaCO3，純水配制成1000 mL，pH調為6.9，121 ℃滅菌15 min，培養溫度28 ℃，相對濕度40%，轉速220 r/min，培養時間30 h。

發酵搖瓶培養基：精糊、黃豆餅粉、玉米漿、MgSO4、KH2PO4、(NH4)2SO4、酵母粉、CaCO3、豆油，純水配制成1000 mL，pH調為6.9，121 ℃滅菌15 min，培養溫度28 ℃，相對濕度40%，轉速220 r/min，培養時間6 d。

發酵罐(500 L)培養基：淀粉、魚粉、葡萄糖、酵母粉、NaCl、KH2PO4、CaCO3、玉米漿、MgSO4、NH4NO3、豆油、正丙醇(發酵24 h后加入)，pH調為6.9，培養溫度28 ℃，相對濕度40%，培養時間6 d。

1.3方法

1.3.1孢子懸浮液的制備按文獻[10]的方法，并作適當改進。利用接種環刮取成熟新鮮斜面孢子，然后用5 mL pH 6.86的無菌磷酸緩沖液沖洗，將洗下的孢子液倒入裝有10粒玻璃珠的50 mL三角錐形瓶中，再反復沖洗2次，所得菌液全部倒入三角錐形瓶，28 ℃，220 r/min震蕩30 min，以脫脂棉過濾，稀釋至10-5備用。

1.3.2常壓室溫等離子體(ARTP)誘變按文獻[6,11]的方法，并作適當改進。采用純度為99.99%的氦氣作為ARTP的工作氣體，處理功率80 W，等離子體發生器出口與待處理樣品之間的距離為4 mm，氣體流量9.0 L/min。將制備好的50 μL孢子懸液均勻涂布于不銹鋼載片上，然后對其進行照射處理，照射時間分別為0 s(對照)、40 s、80 s、120 s、160 s，用50 μL pH 6.86的無菌磷酸緩沖液沖洗，將照射后的菌懸液洗脫至平板中，重復洗脫3次，均勻涂布于平板，在28 ℃培養箱中倒置培養7 d，統計致死率。

1.3.3紫外線(UV)誘變按文獻[5,10]的方法，并作適當改進。吸取3 mL制備好的孢子懸浮液于帶磁力針的平皿內(直徑9 cm)，15W紫外燈(波長253.7 nm)打開預熱25 min，然后將盛有孢子懸液的平皿放到磁力攪拌器上，距離紫外燈管30 cm，然后打開平皿蓋，分別照射0 s(對照)、15 s、30 s、60 s、90 s，蓋上平皿蓋，整個誘變過程盡量在黑暗環境下進行，防止光修復作用。誘變結束后，在黑暗中放置1 h，吸取處理過的孢子懸浮液，均勻涂布于平板，在28 ℃培養箱中倒置培養7 d，統計致死率。

1.3.4亞硝基胍(NTG)誘變按文獻[12]的方法，并作適當改進。吸取5 mL孢子懸浮液于50 mL的三角瓶中，加入150 μL NTG溶液(濃度10 g/L)，放置于28 ℃，220 r/min的搖床間分別震蕩30、60、90、120、180、240 min，誘變處理后菌液倒入10 mL離心管， 6000 r/min離心10 min，棄上清液，用5 mL pH 6.86的無菌磷酸緩沖液洗滌菌體，反復3次，然后再加入5 mL pH 6.86的無菌磷酸緩沖液將菌體制備成菌懸液，取150 μL涂布平板，以未處理的孢子懸浮液作為對照，在28 ℃培養箱中倒置培養7 d，統計致死率。

1.3.5HPLC測定按文獻[13]的方法，并作適當改進。首先過濾發酵液，濾液經10000 r/min離心10 min，取上清液，再經0.22 μm的水相濾膜過濾至液相進樣瓶中。色譜柱為島津shim-pack CLC-ODS柱，柱溫室溫，流動相為體積比1:1的乙腈和醋酸銨(0.1 moL/L)，流速為1 mL/min，檢測波長為232 nm，進樣量為10 μL；待測效價=(標準品的單位×待測樣品的峰面積×待測樣品的稀釋倍數)/標準品的峰面積。

1.3.6致死率和正突變率每個處理30皿，重復3次，以未做誘變處理的孢子懸浮液作為對照，致死率=(對照處理平板菌落-誘變處理平板菌落)/對照處理平板菌落×100%。正突變率=誘變處理后效價高于對照5%的菌株數/誘變處理后菌株總數×100%。

1.3.7菌株遺傳穩定性測定將篩選出的高產菌株先進行斜面保存，產生孢子后取少許孢子轉入另一斜面，此為一代，連續傳代 4次，采用搖瓶發酵法測定每一代螺旋霉素效價，分析螺旋霉素鏈霉菌的遺傳穩定性。

1.3.8Co2+耐受性的檢測孢子懸液稀釋后涂布于含有1.2 mmol/L Co2+的平板上，于28 ℃培養箱倒置培養7 d，檢測菌株的Co2+耐受性。

1.3.9噬菌體抗性的檢測按文獻[14]的方法，作適當改進。將孢子懸液稀釋后涂布于含有噬菌體的平板上，以不含噬菌體的平板為對照，于28 ℃培養箱倒置培養7 d，檢測菌株的噬菌體抗性。

1.3.10豆油耐受性的檢測將孢子懸液稀釋后均勻涂布在含有2.0%豆油的平板上，于28 ℃培養箱倒置培養7 d，檢測菌株的豆油耐受性。

2　結果與分析

2.1出發菌株確定將原始菌株復壯培養后，有8個單菌落的發酵效價較高，經平板劃線分離并進行三次轉接后，結果發現編號SPM-14078的菌株發酵效價最高，為3551 μg/mL，且遺傳性穩定，作為出發菌株(圖1)。

圖1　復壯菌株的效價及遺傳穩定性Fig 1　Potency and inheritance stability of the rejuvenation strains

2.2使用ARTP處理菌株SPM-14078的誘變效果

SPM-14078菌株孢子懸液經ARTP照射處理40、80、120、160 s后，分別涂板，每個處理涂10個板，以未經照射處理的作為對照。培養后，統計每板存活菌落數，計算致死率和正突變率、測定正突變菌株的效價。結果發現，隨著ARTP處理時間增加，菌體致死率顯著升高，當處理時間為160 s時，致死率最高，達到97.3%，處理時間為120 s時，致死率為88.5%(表1)。結合已有的研究報道，確定處理時間120 s為適宜的誘變時間。SPM-14078菌株孢子懸液經ARTP處理120 s后，涂布平板。通過瓊脂柱法進行初篩，得到16株正突變株。將正突變株連續傳代3次，用發酵搖瓶法進行復篩，得到3株編號分別為SPMAR-1601、SPMAR-1602、SPMAR-1603的菌株，其效價分別為11037、9626、11291 μg/mL。

表1　ARTP誘變結果分析Tab 1　Mutagenic results of ARTP

同列數據上標不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)

2.3使用UV處理菌株SPM-14078的誘變效果SPM-14078菌株孢子懸液經UV照射15、30、60、90 s后，分別涂板，每個處理涂10個板，以未經UV處理的作為對照。培養后，統計每板存活菌落數，計算致死率和正突變率，測定正突變菌株的效價。結果發現，隨著UV處理時間增加，菌體致死率顯著升高，當處理時間為90 s時，致死率最高，達到91.4%，處理時間為60 s時，致死率為78.6%(表2)。結合已有的研究報道，確定處理時間60 s為適宜的誘變時間。SPM-14078菌株孢子懸液經UV處理60 s后，涂布平板。通過瓊脂柱法進行初篩，得到22株正突變株。將正突變株連續傳代3次，用發酵搖瓶法進行復篩，得到4株編號分別為SPMU-1601、SPMU-1602、SPMU-1603、SPMU-1604的菌株，其效價分別為9779、10285、10154、9374 μg/mL。

表2　UV誘變結果分析Tab 2　Mutagenic results of UV

同列數據上標不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)

2.4使用NTG處理菌株SPM-14078的誘變效果

SPM-14078菌株孢子懸液經NTG處理30、60、90、120、180、240 min后，分別涂板，每個處理涂10個板，以未經NTG處理的作為對照。培養后，統計每板存活菌落數，計算致死率和正突變率，測定正突變菌株的效價。結果發現，隨著NTG處理時間增加，菌體致死率顯著升高，當處理時間為240 min時，致死率最高，達到95.8%，處理時間為180 min時，致死率為80.4%。結合已有的研究報道，確定處理時間180 min為適宜的誘變時間(表3)。SPM-14078菌株孢子懸液經NTG處理180 min后，稀釋涂布于平板上。通過瓊脂柱法進行初篩，得到19株正突變株。將上述19株正突變株連續傳代3次后，用發酵搖瓶法進行復篩，得到3株編號為SPMN-1601、SPMN-1602、SPMN-1603的優良菌株，其發酵效價分別為12361、9661、10046 μg/mL。

表3　NTG誘變結果分析Tab 3　Mutagenic results of NTG

同列數據上標不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)

2.5優良菌株遺傳穩定性檢測對不同誘變方法獲得優良菌種進行進一步復篩，測定其遺傳穩定性，結果發現，菌株SPMAR-1601、SPMAR-1603、SPMU-1602、SPMN-1603遺傳穩定性好(圖2)。

圖2　優良菌種遺傳穩定性分析Fig 2　Inheritance stability analysis of the fine strains

2.6優良菌株Co2+耐受性的檢測將菌株SPMAR-1601、SPMAR-1603、SPMU-1602、SPMN-1603的菌株孢子懸液稀釋10-5，然后分別涂布于含有1.2 mmoL/L Co2+的培養基平板上，培養后，觀察菌落的生長情況，結果發現，SPMAR-1603、SPMU-1602、SPMN-1603菌株的生長情況好，而SPMAR-1601菌株的生長情況一般(表4)。結果表明，SPMAR-1603、SPMU-1602、SPMN-1603具有較好的Co2+耐受性。

表4　優良菌株Co2+耐受性檢測Tab 4　Co2+ tolerance test of the fine strains

+++表示菌落生長好，++表示菌落生長一般

2.7優良菌株噬菌體抗性的檢測將菌株SPMAR-1603、SPMU-1602、SPMN-1603的菌株孢子懸液稀釋10-5，然后分別涂布于含有噬菌體的培養基平板上，培養后，觀察菌落的生長情況，結果發現，SPMAR-1603、SPMN-1603菌株的生長情況好，SPMU-1602菌株的生長情況一般(表5)。結果表明，SPMAR-1603、SPMN-1603具有較好的噬菌體抗性。

表5　優良菌株噬菌體抗性的檢測Tab 5　Phage resistance test of the fine strains

+++表示菌落生長好，++表示菌落生長一般

2.8優良菌株豆油抗性檢測將菌株SPMAR-1603、SPMN-1603的菌株孢子懸液稀釋為1×10-5，然后分別涂布于含有2.0%豆油的平板上，以不含豆油的平板為對照。培養后，觀察菌落的生長情況，結果發現，含豆油的培養基上SPMAR-1603、SPMN-1603的菌落比不含豆油的培養基上的菌落明顯大，且未見孢子(表6)。結果表明，SPMAR-1603、SPMN-1603菌株均具有較好的豆油抗性。

表6　豆油對優良菌株生長的影響Tab 6　Phage resistance test of the fine strains

2.9優良菌株發酵特性分析將選育出的優良菌株SPMAR-1603、SPMN-1603以及原始菌株SPM-14078進行發酵罐發酵，發酵后，分別測定效價、組分、菌絲濃度、殘糖量、殘油量，結果發現，SPMAR-1603菌種發酵液中效價和菌絲濃度最高，殘糖和殘油量最低(表7)。

表7　優良菌株發酵特性分析Tab 7　Fermentation characteristic analysis of the fine strains

3　討論與小結

菌種對螺旋霉素發酵生產起著關鍵性作用，劉守強等[5]、周德龍等[6]、王建國[7]等分別采用UV、ARTP、NTG誘變方法，對螺旋霉素發酵菌種進行了誘變選育，所選育出菌株的效價均有大幅提高，其中周德龍等[6]利用ARTP誘變方法選育出菌株的效價提高幅度最大。本研究運用ARTP、UV、NTG三種誘變方法，分別對螺旋霉素鏈霉菌進行誘變處理，結果表明這三種方法均可誘導菌株產生有效的突變，其中ARTP誘變效果最佳。這與上述三位研究者的研究結論相一致。

酰基激酶和酰基CoA合成酶是螺旋霉素生物合成過程中的限速酶，短鏈脂肪酸可誘導這兩個酶的合成。發酵液中的豆油一方面可以滿足菌體的生長，更重要的是豆油被菌體分解產生乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸，這些短鏈脂肪酸可促進酰基激酶和酰基CoA合成酶的合成，從而促進螺旋霉素的生物合成，有利于提高其產量。Co2+可增強酰基激酶和酰基CoA合成酶的活性，在發酵液中添加Co2+可激發這兩個酶的活性，促進螺旋霉素的生物合成，也有利于提高其產量。本研究篩選出的優良菌株SPMAR-1603具有較好豆油耐受性和Co2+耐受性，這很可能是其效價得以大幅度提高的主要原因。螺旋霉素發酵生產易受噬菌體污染的影響，選育噬菌體抗性的菌株是防治噬菌體污染行之有效的辦法。本研究篩選出的優良菌株SPMAR-1603具有較好的噬菌體抗性，可有效抑制發酵生產過程中噬菌體的污染，有助于提高生產效率。有關SPMAR-1603的生產試驗正在進行之中，菌株的優良特性在規模化生產中的實際表現還有待進一步驗證。

參考文獻：

[1]朱 峰, 王爾健. 螺旋霉素的再評價[J]. 中國抗生素雜志, 1991, 46(3): 231-236.

Zhu F, Wang E J. Spiramycin reassessed[J]. Chinese Journal of Antibiotics, 1991, 46(3): 231-236.

[2]王 松, 羅 猛, 李 楠, 等. 螺旋霉素的體外抗菌、抗炎活性研究[J]. 黑龍江醫藥, 2011, 24(5): 696-699.

Wang S, Luo M, Li N,etal. Study on antibacterial and anti-inflammatory activity of spiramycin in vitro[J]. Heilongjiang Medicine Journal, 2011, 24(5): 696-699.

[3]Colombie V, Bideaux C, Goma G,etal. Effects of glucose limitation on biomass and spiramycin production by Streptomyces ambofaciens[J]. Bioprocess and Biosystems engineering, 2005, 28: 55-61.

[4]Jin Z H, Cen P L. Improved production of spiramycin by mutant Streptomyces ambofaciens[J]. Journal of Zhejiang University Science, 2004, 5(6): 689-695.

[5]劉守強, 趙 中, 劉 果, 等. 紫外誘變復合重金屬離子抗性突變選育螺旋霉素高產菌株[J]. 化學與生物工程, 2016, 33(5): 26-40.

Liu S Q, Zhang Z, Liu G,etal. Screening spiramycin high-producing strain with UV and heavy metal ion resistance mutation[J]. Chemistry & Bioengineering, 2016, 33(5): 26-40.

[6]周德龍, 牛 春, 張 萍. 常壓室溫等離子體(ARTP)誘變及工藝優化篩選螺旋霉素高產菌株[J].內蒙古科技與經濟, 2016, 24: 96-101.

Zhou D L, Niu C, Zhang P. Screening spiramycin high-producing strain with ARTP mutagenesis and process optimization[J]. Inner Mongolia Science Technology & Economy, 2016, 24: 96-101.

[7]王建國, 張 立, 李 華, 等. 亞硝基胍誘變螺旋霉素高產菌株的選育[J]. 山東化工, 2016, 45(9): 87-88.

Wang J G, Zhang L, Li H,etal. Breeding of NTG mutagenesis of spiranmycin producing strain[J]. ShangDong Chemical industry, 2016, 45(9): 87-88.

[8]Karray F, Darbon E, Oestreicher N,etal. Organization of the biosynthetic gene cluster for the macrolide antibiotic spiramycin in Streptomycesambofaciens[J]. Microbiology, 2007, 153: 4111-4122.

[9]Karray F, Darbon E, Nguyen H C. Regulation of the Biosynthesis of the Macrolide Antibiotic Spiramycin in Streptomyces ambofaciens[J]. Journal of Bacteriology, 2010, 192(21):5813-5821.

[10] 李春玲, 丁亞蓮, 謝文靜, 等. 不同誘變方法對TL-15028菌株產泰樂菌素相關性能的影響[J]. 中國獸藥雜志, 2016, 50(12): 29-33.

Li C L, Ding Y L, Xie W J,etal. The effect of different induction mutation method on production performance for tylosin in TL-15028 strain[J]. Chinese journal of veterin drug, 2016, 50(12): 29-33.

[11] 沈小靜, 張 萍, 石彥鵬. 常壓室溫等離子體結合紫外誘變篩選紅霉素高產菌株[J]. 中國獸藥雜志, 2015, 49(1) : 19-23.

Shen X J, Zhang P, Shi Y P. A mutant strain with high erythromycin yield obtained by using novel atmosphheric and room temperature plasmas and UV mutation[J]. Chinese journal of veterin drug, 2015, 49(1) : 19-23.

[12] 劉文玉, 史應武, 王杏芹, 等. 亞硝基胍誘變選育低溫β-半乳糖苷酶高產菌[J]. 生物技術通報, 2008, 4: 185-187.

Liu W Y, Shi Y W, Wang X Q,etal. Screening of High-producing cold-adapted β-D-Galactosidase strain by NTG Mutagenesis[J]. Biotechnology Bulletin, 2008, 4: 185-187.

[13] 楊麗桃, 何家俊. HPLC法測定復方螺旋霉素片中螺旋霉素和甲硝唑的含量[J]. 廣東藥學院學報, 1998, 14(1): 39-40.

Yang L T, He J J. The content determination of spiramycin and metronidazole in compound spiramycin tablets with HPLC[J]. Journal of Guangdong Pharmaceutical University, 1998, 14(1): 39-40.

[14] 葉蕊芳, 鄭 黎, 謝志梅, 等. 螺旋霉素產生菌抗噬菌體菌株的選育[J]. 華東理工大學學報, 1997, 23(10): 545-549.

Ye R F, Zheng L, Xie Z M,etal. Screening ofStreptomycesspiramyceticusfor phage-resistant strain [J]. Journal of East China University of Science and Technology, 1997, 23(10): 545-549.