電針對面神經損傷兔面神經核中GDNF、CHAT表達的影響

童　威，何劍波，張文岐，晁　旭，陳謙謙

(1. 陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712000；2. 陜西省西安市西電集團醫院，陜西 西安 710000；3. 陜西中醫藥大學第二附屬醫院，陜西 咸陽 712000)

面神經損傷在臨床中較常見，目前多認為與自主神經功能不穩、局部血液循環障礙、病毒感染等有關，多予以抗病毒、營養神經等治療，嚴重者行外科手術，但部分患者效果不理想。近年研究顯示，針灸治療周圍神經損傷有一定優勢[1]，其中電針對面神經損傷療效顯著，能促進面神經損傷修復，使組織中神經生長因子表達增強[2-3]，但電針治療促進面神經損傷修復的機制尚不清楚。本研究利用兔面神經損傷模型，觀察了電針對面神經核中膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)、膽堿乙酰轉移酶(CHAT)表達及神經元細胞形態的影響，旨在探討電針對面神經損傷再生修復的作用機制。

1　實驗資料

1.1實驗動物新西蘭健康家兔[西安交通大學醫學部實驗動物中心提供, 合格證號：SCXK(陜)2014-003]76只，雌雄各半，6～8月齡，體質量(2.5±0.25)kg，單籠普通顆粒飼料喂養。

1.2分組及造模將健康家兔隨機分為假手術組、模型組、電針組、西藥組，其中假手術組4只，余每組24只。除假手術組外，其余組均參照牙祖蒙[4]、姜國華等[5]動物模型制備方法制備面神經損傷模型：采用3%戊巴比妥鈉1 mL/kg靜脈麻醉家兔，左側面部手術部位用脫毛劑脫毛、消毒，鋪無菌孔巾，取耳屏前至下頜角下緣“S”形切口，鈍性剝離皮膚、皮下組織，在腮腺筋膜表面向前剝開皮瓣，暴露面神經頰支，在距莖乳孔0.5 cm處(定位)用小號持針器鉗夾面神經，滿扣(壓力約5 kg定量)時間為5 s(定時)，損傷面寬約1.5 mm，最后分層縫合肌肉、皮膚，飼養。假手術組麻醉后切開皮膚及鈍性剝離面神經，不做鉗夾，相同方法縫合。

1.3干預處理假手術組、模型組術后不給予干預；西藥組造模后第1天開始給予維生素B110 mg、維生素B1250 μg加地塞米松2 mg肌肉注射，1次/d，地塞米松每7 d減半，連續4周；電針組造模后第1天開始進行電針治療，每天連續治療30 min，治療5 d后休息2 d，療程4周。電針腧穴定位參照中國針灸學會實驗針灸分會制定的《動物針灸穴位圖譜》、中國獸牧醫學會編寫的《中國獸醫針灸學》及《實驗針灸學》。翳風：乳突尖至下頜升支后緣垂線之中點，直刺1.0 cm；顴髎：外眥垂線和顴骨顳突下緣凹陷處，直刺垂直進針約2.0 cm；地倉：口角外側1.0 cm，直刺0.5 cm；頰車：下頜角前上方咬肌最豐隆處中點，直刺0.5 cm；陽白：眶上緣中點上方約0.5 cm處，平刺進針約 1.5 cm；四白：眶下緣中點向下 0.5 cm 處，斜刺45°角進針約 2.0 cm；合谷：掌背側第一、第二掌骨間，約第二掌骨中點橈側，直刺0.2 cm。頰車與地倉連接；翳風與顴繆連接；陽白與四白連接；合谷：埋針，不予以電刺激。采用疏密波進行刺激，頻率為18～20 Hz，電壓1.5 V。

1.4樣本采集分別于術后1，2，3，4周，每組隨機取6只兔(假手術組每次1只)，用3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)麻醉后,自領下至小腹行胸、腹聯合切口，切斷肋骨，剪斷膈肌，暴露心臟。穿刺針頭刺入左心室，用軟靜脈留置導管沿左心室經主動脈瓣插入主動脈，剪開左心耳，先用冰生理鹽水250 mL快速沖洗組織內血液，待流出的液體清亮后，用4%多聚甲醛固定液快速推注約400 mL，取左側腦干組織(面神經核位于腦橋下部靠近腹側)。將所取標本迅速放入含有1∶1 000 DEPC的4%多聚甲醛0.1 mol/L PBS固定液中固定，室溫下經梯度乙醇脫水，石蠟包埋，以備切片。

1.5面神經核中神經元細胞形態觀察與GDNF、CHAT檢測切片HE染色后進行鏡下觀察。免疫組織化學法進行GDNF、CHAT檢測，試劑盒均購自武漢博奧森公司,按試劑盒操作說明進行，以細胞漿內或核膜上出現棕黃色顆粒或斑片為陽性細胞，每兔取相同部位的切片，在10×40倍光鏡下每張片取5個視野，在光鏡下計數面神經核中GDNF、CHAT陽性表達細胞數。

2　結　　果

2.1各組面神經核中神經元細胞形態HE染色后，假手術組面神經核神經元胞體中細胞輪廓清晰，結構完整。模型組神經元細胞數目減少，細胞體積增大，細胞核濃縮、變形，部分細胞甚至出現核仁消失、變性壞死，可見點狀或片狀染色增加或減少, 出現圓形空泡，細胞輪廓模糊或消失。與模型組比較，電針組、西藥組神經細胞輪廓結構清晰完整，腫脹、空泡數目減少，細胞數目增多。見圖1～4。

圖1　術后4周假手術組兔面神經元細胞形態(HE，×400)

圖2　術后4周電針組兔面神經元細胞形態(HE，×400)

2.2各組兔面神經核中GDNF表達情況術后1周，4組間面神經核中GDNF表達情況比較差異無統計學意義(P均>0.05)；術后2，3，4周，模型組GDNF陽性表達細胞數均明顯低于假手術組(P均<0.05)，且呈先下降后上升的趨勢，術后3周陽性表達數最少，術后4周陽性表達數回升；電針組、西藥組GDNF陽性表達數均明顯高于模型組(P均<0.05)，且電針組明顯高于西藥組(P均<0.05)。見表1及圖5～8。

圖3　術后4周模型組兔面神經元細胞形態(HE，×400)

圖4　術后4周西藥組兔面神經元細胞形態(HE，×400)

表1　各組兔面神經核中GDNF表達情況個)

注：①與模型組比較，P<0.05；②與西藥組比較，P<0.05。

圖5　術后4周假手術組兔面神經核中GDNF表達情況(免疫組化，×400)

2.3各組兔面神經核中CHAT表達情況術后1，2,3,4周，模型組CHAT陽性表達數均明顯低于假手術組(P均<0.05)，且呈先下降后上升的趨勢，

圖6　術后4周電針組兔面神經核中GDNF表達情況(免疫組化，×400)

圖7　術后4周模型組兔面神經核中GDNF表達情況(免疫組化，×400)

圖8　術后4周西藥組兔面神經核中GDNF表達情況(免疫組化，×400)

術后2周陽性表達數最少；電針組、西藥組CHAT陽性表達數隨時間增加而增高，相鄰兩治療階段比較差異有統計學意義(P均<0.05)。電針組各時間段CHAT陽性表達數均明顯高于模型組和西藥組(P均<0.05)；術后1周，西藥組CHAT陽性表達數與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)，但術后2，3，4周均明顯高于模型組(P均<0.05)。見表2及圖9～12。

表2　各組兔面神經核中CHAT表達情況個)

注：①與模型組比較，P<0.05；②與西藥組比較，P<0.05。

圖9　術后4周假手術組兔面神經核CHAT表達情況(免疫組化，×400)

圖10　術后4周電針組兔面神經核CHAT表達情況(免疫組化，×400)

圖11　術后4周模型組兔面神經核CHAT表達情況(免疫組化，×400)

圖12　術后4周西藥組兔面神經核CHAT表達情況(免疫組化，×400)

3　討　　論

中醫對周圍性面神經損傷的治療有豐富的經驗，其中針灸質量可促進氣血循環，改善代謝，改善肢體痿軟[6]。劉志丹等[7]綜合大量的實踐研究文獻認為選用經穴治療面神經損傷具有較好的療效；劉佰成等[8]觀察表明，運用針灸綜合治療周圍性面癱療效明顯優于單純中藥治療；姜喜鳳等[9]報道，運用普通針刺結合電針治療周圍性面癱的效果明顯優于單純使用透針治療；蔣小旭[10]運用電針治療面神經炎取得良好效果。上述研究表明針灸治療面神經損傷具有較好的療效。本實驗在現代科技的基礎上，采用電針疏密波刺激地倉、頰車等具有通經活絡、溫經散寒作用的穴位，進一步觀察了電針對面神經損傷的修復作用，結果顯示，電針組神經細胞輪廓結構清晰完整，腫脹、空泡數目減少，細胞數目增多，證實電針治療可修復面神經損傷。

GDNF可以保護多巴胺(DA)運動神經元，促進中樞運動神經元、外周運動神經元、感覺神經元、交感神經元等的存活和生長發育,在中樞神經系統生長發育、損傷修復等過程中發揮重要的神經營養作用，與帕金森病、腦缺血、神經性疼痛及癲癇等疾病密切相關[11]。 GDNF對面神經損傷的修復作用機制主要是通過與其受體結合發揮作用，GDNF受體系統主要是GDNF家族受體α(GFRα)和Ret蛋白組成的復合受體系統，一部分通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)結合位點錨定于細胞膜外表面的GFRα，另一部分通過跨膜的酪氨酸激酶Ret蛋白，信號得以傳遞。跨膜的Ret蛋白能夠調節細胞的生長、分化[12]。GDNF與細胞表面的GFRα 結合形成GDNF-GFRα復合體后激活Ret受體，使細胞內Ret-Shc-Grb2蛋白復合體形成，而后Ret-Shc-Grb2蛋白復合體激活相關蛋白，從而引起一系列信號傳導，發揮其生物學作用，促進神經元的損傷修復[13]。本實驗結果顯示，術后2，3，4周，模型組GDNF陽性表達細胞數均明顯低于假手術組，且呈先下降后上升的趨勢；電針組、西藥組GDNF陽性表達數均明顯高于模型組，且電針組明顯高于西藥組。提示電針刺激后，面神經核內GDNF表達升高，從而引起GDNF與其受體結合增加，兩者結合可以促進神經系統生長發育、損傷修復等。

CHAT是一種在神經元胞體內合成的酶，當該轉移酶被合成以后，通過軸質流動方式轉移到神經軸突末端，其功能是將乙酰輔酶A轉移到膽堿上，導致神經遞質乙酰膽堿的形成。膽堿能系統參與多種神經功能的作用，一些膽堿能神經元的改變能導致神經系統疾病的發生，故CHAT通常被用來標記神經元功能狀態。本實驗結果顯示，術后1，2,3,4周模型組CHAT陽性表達數均明顯低于假手術組，且呈先下降后上升的趨勢；電針組、西藥組CHAT陽性表達數隨時間增加而增高，且電針組各時間段CHAT陽性表達數均明顯高于模型組和西藥組。提示電針刺激可增加CHAT的表達，CHAT的增多有利于乙酰膽堿的形成，進一步促進膽堿能系統參與多種神經功能，有利于損傷面神經的再生修復。

綜上所述，電針刺激可促進面神經損傷修復，其機制可能與增加面神經核中GDNF、CHAT的表達有關。

[參考文獻]

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