蘇尼替尼對雌二醇誘發的去卵巢大鼠子宮內膜滲出和血管通透性的干預作用研究*

李長興，莫晨玲，李建華，孔德霞，李娟，代冬芳，永勝

（1.青海大學醫學院，青海 西寧 810001；2.青海省第四人民醫院，青海 西寧 810007；3.青海省西寧市第二人民醫院，青海 西寧 810001）

蘇尼替尼（Sutveratrol，Sut）為一種小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑，對血管內皮細胞生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）—VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3的酪氨酸激酶具有抑制作用，選擇性阻斷VEGFR信號通路，使血管內皮生長因子和血管內皮生長因子受體表達減少，從而抑制腫瘤血管的生成，達到抑制腫瘤生長和轉移的目的。雖然對此相應的毒理機制進行了大量的研究，但對外源性雌二醇誘發去卵巢大鼠的子宮內膜滲出和血清血管內皮細胞生長因子（VEGF）濃度的干預作用的研究較為少見。本實驗以去卵巢大鼠為動物模型，研究Sut對雌二醇誘發的去卵巢大鼠子宮內膜滲出和VEGF濃度的干預作用。

1　材料與方法

1.1　動物的選擇和分組

動物分組、模型復制參照蘭州大學基礎醫學院生理研究所課題組的方法[1-2]。選用健康雌性SD大鼠，體重（180±20）g，由蘭州大學動物實驗中心提供，二級動物室飼養。隨機分為假手術組（Sham組）、卵巢切除組（Ovx組）、卵巢切除+17β-雌二醇組（17β-estradiol，Est）組（Ovx+Est組）、卵巢切除+17-β雌二醇+蘇尼替尼組（Ovx+Est+Sut組）4組，每組6只。大鼠經氯胺酮（100 mg/kg）腹腔注射麻醉后，脊柱兩側肋弓2 cm下切口開腹，暴露卵巢，結扎切除雙側卵巢后關腹，均為無菌操作；Sham組僅打開腹腔后暴露卵巢，只切除卵巢周圍5 mm×5 mm脂肪組織后關腹。術后1周開始連續皮下注射給藥3周。Ovx+Est組給予1.0 mg/kg雌二醇注射液（溶媒為芝麻油），Ovx+Est+Sut組給予1.0 mg/kg 17β-雌二醇和1 mg/kg Sut（溶媒為芝麻油），Sham組、Ovx組每天給予等量的芝麻油。

1.2　試劑及儀器

1.2.1試劑17β-雌二醇（美國Sigma公司），Sut（廣州愛純醫藥科技有限公司），大鼠VEGF酶聯免疫分析試劑（上海川翔生物制品有限公司）。

1.2.2儀器分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），光學顯微鏡及照相系統（重慶廣電儀器有限公司 XSN-HS7），全自動酶標儀（Bio-Tek ELX808IU），低溫高速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司TGL-16），電子天平（上海精密科學儀器有限公司）。

1.3　觀察指標及方法

1.3.1大鼠子宮系數的測定末期給藥稱重，12 h后氯胺酮腹腔注射麻醉后，結扎子宮周圍血管后摘取子宮，稱重記錄，算出子宮系數。子宮系數=子宮重量/大鼠體重。

1.3.2VEGF的測定從左心室抽取血樣，離心后取血清，放入冷凍管。根據酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒說明書中提供的方法測出血清中VEGF的吸光值，根據標準曲線，算出VEGF的濃度，比較各組之間的差異。

1.3.3子宮內膜形態學的觀察所取子宮組織用4 mol/L的多聚甲醛進行固定，常規脫水后石蠟包埋，切片，進行HE染色。光學顯微鏡低倍和高倍鏡下觀察各組子宮內膜形態變化。

1.4　統計學方法

采用SPSS17.0軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差分析有意義的基礎上，兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　大鼠子宮濕重及子宮系數測定結果

4組大鼠子宮濕重及子宮系數比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；與Ovx組比較，Ovx+Est組的子宮濕重和子宮系數均增加；與Ovx+Est組比較，Ovx+Est+Sut組大鼠體重、子宮濕重及子宮系數下降。見表1。

2.2　子宮內膜形態

Sham組：屬正常分泌期大鼠子宮內膜，結構清楚。腺體分布均勻，呈柱狀，排列規則。在內膜和肌層中可見嗜酸性粒細胞的滲出（見圖1）。Ovx組：子宮明顯萎縮，內膜變薄，上皮細胞萎縮呈低柱狀，細胞排列緊密，細胞質減小，未能在內膜和肌層中發現嗜酸性粒細胞的滲出（見圖2）。Ovx+Est組：子宮內膜明顯增厚，腺上皮細胞水腫，腺體數量增加，腺腔擴大。在內膜和肌層中發現大量嗜酸性粒細胞的滲出（見圖3）。Ovx+Est+Sut組：子宮內膜上皮層變薄，上皮細胞體積稍大，細胞質疏松，在內膜和肌層中只發現少量的嗜酸性粒細胞的滲出（見圖4）。

表1　各組大鼠子宮濕重及子宮系數比較 （±s）

表1　各組大鼠子宮濕重及子宮系數比較 （±s）

注：1）與Ovx+Est組比較，P ＜0.05；2）與Ovx組比較，P ＜0.05

組別　　術后3周體重/g　　子宮濕重/g　　子宮系數（×10-3）Sham 組　201.200±4.251）　0.121±0.011）2）　0.620±0.081）2）Ovx 組　208.420±5.63　0.048±0.011）　0.150±0.061）Ovx+Est組　221.230±4.17　0.198±0.051）　0.890±0.161）Ovx+Est+Sut組 200.640±20.501）　0.116±0.042）　0.580±0.062）F值　4.523　24.770　58.730 P值　0.000　0.000　0.000

圖1　Sham組子宮內膜形態 （左：×100，右：×400）

圖2　Ovx組子宮內膜形態 （左：×100，右：×400）

圖3　Ovx+Est組子宮內膜形態（左：×100，右：×400）

圖4　Ovx+Est+Sut子宮內膜形態（左：×100，右：×400）

2.3　VEGF濃度比較

4組VEGF濃度比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；與Ovx組相比，給予外源性的17β-雌激素后，Ovx+Est組血清VEGF的濃度上升；給予Sut后，Sut可使Ovx+Est+Sut組血清VEGF濃度低于Ovx+Est組。見表2。

表2　各組VEGF濃度比較 （n =6，pg/ml，±s）

表2　各組VEGF濃度比較 （n =6，pg/ml，±s）

注：1）與Ovx+Est組比較，P ＜0.05；2）與Ovx組比較，P ＜0.05；3）與 Sham 組比較，P ＜0.05

組別　VEGF Sham 組　728.64±90.071）2）Ovx 組　377.94±65.811）Ovx+Est組　937.37±81.25 Ovx+Est+Sut組　387.44±56.391）3）F值　80.850 P值　0.000

3　討論

本實驗研究用去卵巢大鼠為動物模型，研究Sut對外源性雌激素誘發去卵巢大鼠子宮內膜滲出的干預作用。實驗發現，子宮內膜是雌激素作用的主要靶器官，其組織形態學的改變是隨著雌激素水平的不同而產生變化的，去卵巢大鼠給予外源性雌激素后，可使子宮重量及系數增加，子宮內膜增生，嗜酸性粒細胞滲出明顯，血清VEGF的濃度升高；給予Sut干預后，大鼠子宮濕重及子宮系數降低，子宮內膜中嗜酸性粒細胞數減少，血清VEGF濃度也降低。研究[3-4]證明了Sut可抑制外源性雌激素對子宮內膜的滲出，抑制VEGF的生成。

VEGF蛋白是一種具有高度保守性的糖蛋白，是目前發現的作用最強、特異性最高的促血管生成因子，在促進內皮細胞增生、遷移，促進萌芽過程中起重要調節作用，并在多種惡性腫瘤中過度表達，與腫瘤的生長、轉移、預后密切相關[5]。VEGF接受雌孕激素的調節，雌激素可促進VEGF mRNA的生成，其生成量依賴于雌激素的濃度和作用時間[6]。VEGF有VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3 3種受體，屬于受體酪氨酸激酶超家族膜蛋白，其中膜內是酪氨酸激酶區，通過內化作用發揮上述作用。VEGFR-1表達于單核細胞、滋養層細胞、內皮細胞等，是第1個被確定為血管內皮生長因子受體RTKs，在成血管細胞組合為成血管的過程中發揮重要作用；VEGFR-2是VEGF的主要功能受體，在成血管細胞的早期發育中發揮重要作用；VEGFR-3可直接影響微血管分支的發生及血管網的構成，主要接受Snail的調控[7-10]。

Sut為吲哚酮類衍生物，為小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑，對VEGFR-2有特異性抑制作用，可選擇性阻斷VEGFR信號通路，可抑制腫瘤血管的生成，從而抑制腫瘤活性和血管形成[11]。同時Sut對血小板衍生生長因子受體β（PDGFRβ）、干細胞因子受體（c2Kit）和胎肝激酶3（Flt3）受體具有抑制作用[12]。抑制VEGFR-2已成為阻斷VEGF通路發揮促血管生成作用的有效方法。給予Sut后，Sut可抑制VEGF的表達，阻止VEGF與VEGFR的胞外部分結合，進而抑制胞內區的激酶區磷酸化和活化，抑制與血管生成密切相關PI3K-AKT-mTOR、Ras-Raf-MEK-ERK等信號通路，使血清VEGF濃度下降，從而使血管通透性下降， 抑制血管表皮細胞的生長、遷移進而導致血管的增生，使滲出減少[13-14]。

總之，Sut作為小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑，對雌二醇誘發的子宮內膜和血清VEGF濃度的影響，可以為婦產科腫瘤的防治和治療提供新的思路。

參 考 文 獻：

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