MicroRNA-195參與切應力對血管內(nèi)皮細胞炎癥調(diào)控作用的研究

吳小苑，范文冬

（1.廣東省職業(yè)病防治院 廣東 廣州 510300；2.中山大學附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510080）

血流切應力決定著動脈粥樣硬化斑塊的非隨機分布，對維持血管內(nèi)皮細胞（endothelial cells，ECs）結(jié)構與功能的穩(wěn)定起關鍵作用。生理范圍內(nèi)的血流切應力保護ECs，阻抑動脈粥樣硬化病變的分子與生物力學機制仍不十分清楚[1]。新近研究發(fā)現(xiàn)，生理切應力能誘導ECs的microRNAs（miRNAs）表達譜發(fā)生改變，并通過miRNAs調(diào)控ECs的功能[2-5]，但目前只有miR-19a[4]、miR-23b[5]及miR-21[2]等少數(shù)幾個切應力誘導miRNAs的功能得到部分闡明。

隨著研究的不斷深入，動脈粥樣硬化被認為是一種慢性炎癥反應性疾病[6]。近年來，miRNA調(diào)控動脈粥樣硬化炎癥反應機制的研究正逐漸成為心血管研究領域的熱點。當前研究表明生理切應力誘導miR-27b[2，4-5]、miR-143/145[7]、miR-195[2，4]、miR-19a[4]、miR-23b[5]及miR-10a[8]等表達上調(diào)；誘導miR-92a[9]、miR-221[5]、miR-20a[5]及 miR-182[4]等表達下調(diào)。其中miR-27b、miR-143/145及miR-195等在ECs中的功能還不清楚，而miR-195與ECs炎癥反應的關系目前國內(nèi)外未見有相關報道，本研究進一步驗證它們的確受到生理切應力的調(diào)控以及miR-195與ECs炎癥的相關關系。

1　材料與方法

1.1　材料

人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）。MicroRNA mimics及inhibitors：miR-27b、miR-143/145、miR-195、miR-126 mimics、miR-195 inhibitors及相應對照（NC）和inhibitor-NC（INC）（廣州，銳博生物）。

1.2　miRNAs的qRT-PCR

驗證生理切應力調(diào)節(jié)ECs miRNAs的表達：15 dyne/cm2的生理切應力處理HUVEC，24 h后利用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測內(nèi)皮細胞miR-27b、miR-143/145及miR-195等的表達變化。①miRNAs的逆轉(zhuǎn)錄：使用Life Technology的TaqMan? MicroRNA Assays試劑盒，按照其說明書的介紹，用miRNAs特異性引物進行逆轉(zhuǎn)錄；②qRTPCR檢測：置于LightCycler?480儀器中，以U6作為內(nèi)參，按照說明書介紹的方法擴增45個循環(huán)，每個樣品做3個重復。

1.3　切應力發(fā)生裝置的構建

這個系統(tǒng)由切應力處理腔室（μ-Slide I 0.4 Luer，ibidi），蠕動泵，以及各種導管組成。HUVEC細胞生長在μ-Slide I 0.4 Luer中，形成單細胞層后，在超凈臺中將培養(yǎng)液輸送導管與裝有培養(yǎng)基的透氣廣口瓶以及蠕動泵相連。由蠕動泵驅(qū)動培養(yǎng)基流經(jīng)生長有細胞的μ-Slide I 0.4 Luer腔室，整個系統(tǒng)置于二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中。切應力與流速的關系可根據(jù)μ-Slide I 0.4 Luer腔室供應商ibidi所供的公式計算：

1.4　細胞轉(zhuǎn)染實驗

miRNAs mimics及inhibitors轉(zhuǎn)染HUVEC細胞：分別用125μl的opti-MEM培養(yǎng)基稀釋小分子RNA和Lipofectamine RNAiMAX試劑，將上述2種溶液混合并用移液器輕輕混勻，室溫放置25 min。在等待的過程中給細胞更換新鮮的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基（endothelial cell medium，ECM）。達到孵育時間后，將250μl opti-MEM、RNA及轉(zhuǎn)染試劑的混合液，逐滴加入12孔板的相應孔中，輕輕搖動12孔板以混勻轉(zhuǎn)染混合物，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后更換新鮮ECM完全培養(yǎng)基，細胞轉(zhuǎn)染48～72 h后按實驗需要處理細胞。

1.5　Western blot

體外轉(zhuǎn)染miR-195等 mimics及inhibitors至HUVEC，通過Western blot檢測ECs中p65的磷酸化（P-p65）水平及內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、кB抑制蛋白（IкBα）等炎癥相關因子的表達。Western blot方法包括：SDS PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、ECL顯色，結(jié)果掃描后用Quantity One（biorad）軟件分析灰度值。

1.6　免疫熒光

體外轉(zhuǎn)染miR-195 mimics及inhibitors至HUVEC，通過免疫熒光檢測miR-195對ECs的炎癥控制水平，主要檢測轉(zhuǎn)錄因子核因子кB（NF-κB）的核轉(zhuǎn)運情況。免疫熒光方法中所用抗體名稱NF-κB，CST抗體編號為4764（兔抗）。一抗稀釋比例，1︰50左右；二抗1︰5 000。HUVEC經(jīng)過細胞固定、免疫染色后行熒光顯微鏡觀察。

1.7　統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5.0和SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。分子生物學實驗的結(jié)果用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間差異兩組時用t檢驗，多組時采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1　切應力發(fā)生裝置構建及生理切應力調(diào)節(jié)ECs miRNAs的表達

2.1.1切應力誘導HUVEC形態(tài)的改變 為分析切應力對ECs miRNAs表達的影響，首先建立一套體外切應力發(fā)生裝置。采用15 dyne/cm2的切應力處理HUVEC，24 h后用顯微鏡觀察細胞形態(tài)。結(jié)果表明：在生理切應力作用下，HUVEC排列成梭形并沿著切應力作用的方向排列；而未用切應力處理的HUVEC排列不規(guī)則，并且有少量死亡的細胞漂浮。上述結(jié)果證明切應力發(fā)生裝置構建成功，可用于研究切應力對ECs miRNAs的表達的影響[1]。見圖1。

2.1.2生理切應力誘導miR-195等表達上調(diào) 由于miR-126不受切應力的影響[7]，因此以miR-126作為陰性對照，U6作為miRNAs表達的內(nèi)參，運用TaqMan? MicroRNA Assays試劑盒驗證生理切應力是否調(diào)控上述miRNAs的表達。結(jié)果表明：15 dyne/cm2的生理切應力處理HUVEC，24 h后miR-27b、miR-143/145及miR-195等表達上調(diào)（t=4.080、2.145、2.106、2.079，P=0.000、0.020、0.028 及 0.037），而miR-126的表達不受切應力的影響（t=1.655，P=0.103）。見圖 2。

圖1　切應力誘導HUVEC形態(tài)的改變

圖2　生理切應力誘導ECs miRNAs的表達

2.2　miR-195可能參與切應力對ECs炎癥的調(diào)控作用

2.2.1過表達miR-195抑制P-p65的表達NF-κB為1個轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，包括：Rel（cRel），p65（RelA和 NF-κB3），RelB 和 p50（NF-κB1），p52（NF-κB2）。在細胞核內(nèi)，p65識別并結(jié)合特定的DNA序列，控制炎癥基因的轉(zhuǎn)錄。p65的磷酸化（P-p65）促進NF-κB的活性，促進炎癥，為探究miRNA-195介導了ECs炎癥反應，本研究首先建立了一套有效的體外轉(zhuǎn)染miRNAs至HUVEC的方法，通過Western blot證實了在ECs中過表達miR-195抑制了P-p65的表達（t=2.664，P=0.021）（見圖3）。為了探索在內(nèi)皮細胞激活的狀況下miR-195發(fā)揮的功能，在轉(zhuǎn)染miRNAs的同時，加入炎癥刺激因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），結(jié)果與無TNF-α共處理情況一致。

2.2.2抑制內(nèi)源性的miR-195抑制IкBα的表達水平IкBα通過與NF-κB p65結(jié)合抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)運，抑制炎癥。本研究發(fā)現(xiàn)，采用miRNA inhibitors抑制內(nèi)源性的miR-195抑制了IкBα的表達水平（t=3.492，P=0.003）。見圖 4。

2.2.3miR-195在ECs中的可能功能 過表達miR-195對ECs eNOS的表達沒有影響，生理切應力誘導上調(diào)的miR-23b及生理切應力誘導下調(diào)的miR-92a對eNOS的表達影響差異無統(tǒng)計學意義（F=1.786，P=0.07）。而采用miRNA inhibitors抑制內(nèi)源性的miR-195抑制了eNOS的表達水平（t=3.650，P=0.002）（見圖5）。這提示著miR-195可能對于維持eNOS的穩(wěn)定起關鍵作用，但其作用機制不明確，有待進一步的研究。

2.2.4MiR-195抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)運NF-κB的核轉(zhuǎn)位在維持細胞正常生理功能方面發(fā)揮著重要作用，在促炎細胞因子刺激下，NF-κB轉(zhuǎn)位到細胞核中并激活炎癥基因的表達。免疫熒光結(jié)果顯示（見圖6）：加入TNF-α促進了NF-κB的核轉(zhuǎn)運。在ECs中過表達miR-195抑制了NF-κB的核轉(zhuǎn)運，表現(xiàn)為無NF-κB核聚集或者核聚集量非常少，細胞質(zhì)泛紅（miR-195 VS NC）。INC與 miR-195-inhibitor比 較，可見細胞質(zhì)里面也紅色充滿多一些（INC VS miR-195-inhibitor），而miR-195-inhibitor組細胞核內(nèi)可見泛紅熒光，說明抑制miR-195可能促進了NF-κB的核轉(zhuǎn)運，促進炎癥。

圖3　過表達miR-195抑制P-p65的表達

圖4　抑制內(nèi)源性的miR-195抑制IкBα的表達水平

圖5　miR-195的抑制劑抑制ECs eNOS的表達

圖6　miR-195抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)運

3　討論

血流切應力是與血流方向一致的血流對ECs的摩擦力，決定著動脈粥樣硬化斑塊的非隨機分布，對維持ECs功能的穩(wěn)定起關鍵作用[1]。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs參與切應力對ECs功能的調(diào)控作用，然而許多切應力誘導miRNAs在ECs中的功能還未被闡明。

動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病，炎癥的其中1個關鍵調(diào)節(jié)器為轉(zhuǎn)錄因子核因子кB（NF-κB），很長一段時間以來，一直被視為促動脈粥樣硬化的因素，主要因為它調(diào)控著許多涉及動脈粥樣硬化的促炎基因。NF-κB作為促炎和抗炎基因的直接調(diào)節(jié)者以及在細胞存活和增殖方面的調(diào)控角色，可能在維護動脈粥樣硬化過程的微妙平衡中發(fā)揮重要作用[10-11]。轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB家族成員是ECs炎癥反應的重要調(diào)節(jié)因子。在細胞核內(nèi)，RelA（p65）識別并結(jié)合特定的DNA序列，控制炎癥基因的轉(zhuǎn)錄。

近年來，microRNA調(diào)控As炎癥反應機制的研究逐漸成為心血管研究領域的熱點。本研究首先建立了一套有效的體外轉(zhuǎn)染miRNAs至HUVEC的方法，借助該套方法能夠?qū)崿F(xiàn)在ECs中過表達或是下調(diào)相關miRNAs的水平，從而分析它們在ECs中的功能。接著又成功構建了體外切應力模擬發(fā)生裝置，利用該套系統(tǒng)成功的實現(xiàn)了生理切應力對ECs形態(tài)方面的調(diào)控。在證實了該套系統(tǒng)的可靠性后，本研究用該系統(tǒng)所產(chǎn)生的15 dyne/cm2生理切應力處理HUVEC，24 h后miR-27b、miR-143/145及miR-195等表達上調(diào)，而miR-126的表達則不受切應力的影響，這印證了相關文獻的報道[7]。為探究miRNA-195介導了ECs炎癥反應，本研究通過Western blot證實了在ECs中過表達miR-195抑制了P-p65的表達。在靜息情況下，NF-κB二聚體與1個抑制蛋白（кB抑制劑，IкB）結(jié)合保持非活性狀態(tài)。IкBα通過與NF-κB p65結(jié)合抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)運，抑制炎癥。本研究發(fā)現(xiàn)，采用miRNA inhibitors抑制內(nèi)源性的miR-195抑制了IкBα的表達水平。

eNOS在ECs、心肌細胞、血小板等多種細胞上均有表達，在一氧化氮NO的生成過程中也具有重要作用[12-13]。病理狀態(tài)時，eNOS生成障礙或者表達降低，不僅會使血管內(nèi)皮舒張受損，還會加重動脈粥樣硬化等的血管炎癥[14]。本研究采用miRNA inhibitors抑制內(nèi)源性的miR-195也抑制了eNOS的表達水平。NF-κB的核轉(zhuǎn)位在維持細胞正常生理機能方面發(fā)揮著重要作用。在促炎細胞因子刺激下，NF-κB轉(zhuǎn)位到細胞核中并激活炎癥基因的表達。免疫熒光結(jié)果顯示：加入TNFα促進了NF-κB的核轉(zhuǎn)運。在ECs中過表達miR-195抑制了NF-κB的核轉(zhuǎn)運，而抑制miR-195可能促進了NF-κB的核轉(zhuǎn)運，促進炎癥。因此，生理切應力誘導的miR-195功能可以歸納為兩點：①抑制Phospho-NF-κB p65亞基，Ser536位點的磷酸化，抑制NF-κB的活性，從而抑制炎癥。②雖然不能夠促進但卻能夠穩(wěn)定eNOS的表達。

MiRNA通過與靶標基因mRNA的完全匹配結(jié)合，促使mRNA發(fā)生降解，或通過不完全地與靶mRNA的3’非編碼區(qū)（3’UTR）互補結(jié)合抑制靶mRNA的翻譯[15-16]，將蛋白控制在生命活動所需的最佳水平上。根據(jù)miRNA的作用方式，通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)BTRCIRAK2MAP3K7等可能為miRNA-195的潛在靶標。因此，可推測生理切應力誘導miR-195表達上調(diào)，可能通過負調(diào)節(jié)潛在靶標的表達，抑制NF-κB通路，從而影響動脈粥樣硬化炎癥反應。本文較全面地探索了生理切應力誘導的miR-195的血管內(nèi)皮保護功能，有助于進一步闡明動脈粥樣硬化發(fā)生的分子和生物力學機制，為動脈粥樣硬化相關病變的預防提供理論依據(jù)。

參 考 文 獻：

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