耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MLST聯合SCCmec基因分型與耐藥性分析*

紀冰，王凱凱，趙紅梅，董艷，孟瑋，邢敏，孫吉花

（濱州醫學院附屬醫院 1.檢驗科，2.感染管理辦公室，山東 濱州 256603）

金黃色葡萄球菌是臨床分離常見致病菌，由于可以釋放多種毒素等原因造成致病力很強，是現代臨床感染性疾病中非常重要的病原菌[1]。金黃色葡萄球菌在獲得mecA基因后成為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Meticillin - resistant staphylococcus aureus，MRSA），MRSA對多種抗生素表現多重耐藥且耐藥性逐年上升，已經成為現代臨床抗感染治療的難題之一[2]。本研究通過多位點測序分型聯合SCCmec基因分型對MRSA進行基因分型以了解濱州醫學院附屬醫院的主要流行株情況，并探討不同基因型與藥敏譜的關系，明確MRSA的起源、傳播和流行特征，制定本地區最佳防治措施。現報道如下。

1　資料與方法

1.1　菌株來源

收集本院2013年3月-2015年11月臨床分離的經德國西門子公司WalkWAY96 PLUS全自動微生物分析儀鑒定為金黃色葡萄球菌，頭孢西丁紙片擴散法進行篩選，用PCR方法檢測mecA基因確認為MRSA共67株。金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC29213和ATCC43300購于中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會臨床檢驗中心。

1.2　儀器和試劑

WalkWAY96 PLUS全自動微生物分析儀，溶葡萄球菌酶、細菌DNA提取試劑盒、引物、1 000 bp DNA ladder Marker、PCR試劑均購自上海生物工程有限公司，PC33鑒定藥敏復合板購自德國西門子公司。

1.3　藥物敏感試驗

采用WalkWAY96 PLUS自動微生物分析儀PC33鑒定藥敏復合板和Kirby-Bauer法檢測抗菌藥物的敏感性，共測試17種抗菌藥物，分別為：青霉素、氨芐西林、苯唑西林、利奈唑胺、替考拉寧、萬古霉素、環丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星、氯霉素、克林霉素、紅霉素、慶大霉素、利福平、四環素、復方新諾明及米諾環素。

1.4　SCCmec基因分型檢測

對金葡菌DNA提取后進行多重PCR擴增，分型引物/擴增及反應條件均依據ZHANG等[3]的報道，根據擴增條帶分為5型。標準陽性對照菌株：NCTC10042（SCCmecⅠ型）、N315（SCCmecⅡ型）、85/2080（SCCmecⅢ型）、JCSC4744（SCCmecⅣ型）、HS663（SCCmecⅤ型）由濱州醫學院微生物教研室張玉梅惠贈。標準陽性對照菌株保證在規定實驗條件下，保證每次結果的質量控制，與標準菌株出現相同產物長度條帶為該SCCmec型別，SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及V型分別出現613、398、280、776及325 bp條帶。

1.5　MLST分型

提取金黃色葡萄球菌DNA后進行PCR擴增金葡菌染色體DNA上的7個管家基因arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi及yqiL的可變區片段。引物序列依據MLST網站，PCR擴增后PCR產物送上海生物工程公司進行雙向測序，將所測序列與WWW.mlst.net上公布的管家基因的等位基因進行比較，從而獲得所測金黃色葡萄糖球菌的7個管家基因的等位基因譜，然后提交MLST網站根據等位基因譜確定其序列分型（sequence type，ST）。利用eBURST軟件分析ST分型結果，最后得出細胞克隆株（clonal complex，CC）來源。

1.6　方法

采用eBURST軟件分析ST分型結果，采用Whonet 5.6軟件進行細菌耐藥性分析。

2　結果

2.1　SCCmec基因分型結果

在檢測的67株MRSA中，SCCmecⅢ型菌株63株，占94.03%，SCCmecⅣ菌株4株，占5.97%。SCCmecⅢ型和SCCmecⅥ型陽性對照菌株與檢測陽性菌株產物分別于280和776 bp出現條帶。PCR擴增結果見附圖。

2.2　MLST分型結果

經PCR分別擴增67株MRSA的7個管家基因，擴增后的PCR產物經純化后測序，最后提交MLST網站分析，本研究共檢出6個ST型。見表1。

附圖　MRSA的SCCmec多重PCR擴增產物電泳圖譜

2.3　不同基因型的藥物敏感試驗結果

6種型別MRSA菌株對青霉素、氨芐西林等β-內酰胺類抗生素完全耐藥，對萬古霉素、利奈唑烷和替考拉寧完全敏感，ST239-MRSA-SCCmecⅢ、ST399-MRSA-SCCmecⅢ及 ST121-MRSA-SCCmecⅣ均為多重耐藥株（對3種類型以上的抗菌藥物耐藥），ST88-MRSA-SCCmecⅣ、ST221-MRSA-SCCmecⅣ及ST82-MRSA-SCCmecⅣ對非β-內酰胺類的抗菌藥物多表現敏感，為非多重耐藥。見表2。

表1　67株MRSA的MLST結果

表2　不同ST-MRSA-SCCmec基因型別耐藥率 %

3　討論

金黃色葡萄球菌可以引起醫院和社區諸如心內膜炎、菌血癥、肺炎等可危及生命的嚴重感染性疾病，由于金黃色葡萄糖球菌在獲得mecA基因成為MRSA后的多藥耐藥性和交叉耐藥性特點使臨床治療非常棘手，致臨床治療難以控制，目前已成為臨床抗感染治療的一大難題，現在不同地區MRSA的起源、控制醫院內傳播和耐藥特征已成為國內外耐藥監測和流行病學監測的熱點和重點。在眾多基因分型方法中，由ENRIGHT等[4]建立的MLST聯合SCCmec基因分型方法將MRSA的群體生物學、致病性和進化等遺傳特征和SCCmec染色體盒耐藥基因特征相結合對MRSA進行分析，該技術操作簡單易行，可重復性強，由于有固定MLST互聯網站數據庫故可以實現不同實驗室之間進行信息互相傳遞和比較分析，現在已被國際臨床微生物界認定是定義MRSA克隆株的參考方法，適用于公共衛生、分子流行病學和群體進化學研究。通過對國際上的MRSA進行MLST聯合SCCmec基因分型技術分型發現目前主要有5個MRSA流行克隆：ST250-MRSA-SCCmecⅠ（First株 ）、ST247-MRSA-SCCmecⅠ（Iberian株 ）、ST5-MRSA-SCCmecⅡ（NewYork/Japan株）、ST239-MRSA-SCCmecⅢ（Brazilian/Hungarian株）及ST5-MRSA-SCCmecⅣ（Pediatric）。本研究 67株 MRSA流行的主要是ST239-MRSA-Ⅲ，與大部分亞洲國家[5]和國內楊延成[6]研究ST239-MRSA-Ⅲ主要流行株相同，ST239-MRSA-Ⅲ屬于國際流行克隆株中的Brazilian/Hungarian株，也是我國醫院獲得性感染MRSA主要流行株，而研究中ST399-MRSA-SCCmecⅢ、ST121-MRSA-SCCmecⅣ、ST88-MRSA-SCCmecⅣ、ST221-MRSA-SCCmecⅣ及ST82-MRSA-SCCmecⅣ都不是國際流行克隆株，在國內外也能散發檢測到，要求進一步研究其基因特征來確定菌株起源。63株SCCmecⅢ型MRSA有2型ST型別，相對于SCCmecⅢ型MRSA，SCCmecⅣ型MRSA顯示了更為多樣化的ST分型特點，4株就檢測出4型不同的ST型別。所以SCCmecⅣ型MRSA菌株與SCCmecⅢ型相比具有完全不同菌株起源背景和進化路線，提示在濱州醫學院附屬醫院SCCmecⅣ型MRSA可能存在獨特的遺傳背景和進化傳播方式。MLST聯合SCCmec基因分型技術的最主要優勢是已經建立了存有大型基因型數據庫的國際網站，不同國家，不同地區的實驗室可以將自己的檢測結果提交基因型數據庫與公認的已有的流行株進行比較和分析，可以對不同實驗室分離的MRSA的遺傳背景和進化傳播路線進行相關性分析，實現世界范圍內的流行病學調查，監測是否出現國際流行MRSA克隆株，這樣可以防止和控制國際流行MRSA株感染的爆發和流行。

SCCmec分型與藥物敏感試驗結果結合分析顯示SCCmecⅢ型的MRSA株均表現為多重耐藥（對3類藥物及以上耐藥定義為多重耐藥），而SCCmecⅣ型MRSA均未表現為多重耐藥，藥物敏感試驗結果顯示對紅霉素、左氧氟沙星等非β-內酰胺類的抗菌藥物多為表現為敏感，現有研究已經明確Ⅲ型與Ⅳ型MRSA耐藥性差異與不同型別SCCmec基因盒基因結構差異有關[7]。在目前明確的SCCmec分型中，I、Ⅱ、Ⅲ型SCCmec基因盒基因元件結構比較復雜，特別是存在于該3種SCCmec基因盒上的IS431等插入序列有吸引非β-內酰胺類藥物耐藥基因的作用，能將多種非β-內酰胺類藥物耐藥基因整合到SCCmec基因盒中，使之攜帶多種耐藥基因并表現為對多種非β-內酰胺類藥物耐藥。多項研究顯示SCCmecI、Ⅱ及Ⅲ型常存在于醫院獲得性MRSA（hospital aquired MRSA，HA-MRSA）中引起醫院獲得性感染；SCCmecⅣ型和V型基因盒基因元件比較簡單，不存在吸引其他耐藥基因的元件結構，所以一般不攜帶其他非β-內酰胺類藥物耐藥基因，本研究顯示SCCmecⅣ型菌株為非多重耐藥菌。SCCmecⅣ和V型菌株多存在于社區獲得MRSA中，由于其可引起暴發流行和菌株不表現為多重耐藥現在已成為研究的熱點[8]。對于MRSA臨床醫師經驗性治療第一選擇仍為萬古霉素，藥敏結果顯示MRSA未發現耐萬古霉素菌株，但由于萬古霉素的廣泛應用已出現萬古霉素MIC上升趨勢，使萬古霉素使用受到一定限制，國際上更出現萬古霉素耐藥菌株，為了減緩萬古霉素抗生素壓力防止我國出現萬古霉素耐藥金葡菌，本研究根據藥物敏感結果提示攜帶SCCmecⅢ型的醫院獲得性MRSA株對莫西沙星、氯霉素及米諾環素耐藥率較低，經驗治療時可考慮優先選擇使用這些抗生素，而對SCCmecⅣ型菌株對非β-內酰胺類的抗菌藥物敏感性較好，經驗治療社區獲得MRSA可以選擇左氧氟沙星、紅霉素及克林霉素等多種抗生素。

由于MRSA的致病性強、傳播速度快和多重耐藥性，其引起的社區和醫院感染如果監測和控制不當，容易引起院內或社區感染的暴發，嚴重威脅人類健康。故在醫院和社區進行MRSA起源、傳播和進化、抗菌藥物敏感性試驗的研究監測，明確本地區MRSA流行株和盡早發現新的MRSA克隆株的播散，可以根據MRSA菌株起源及傳播特點并獲取耐藥機制，為制定有針對性的預防和控制措施提供有力證據和方法，能有效減少MRSA菌株的傳播和流行。

參 考 文 獻：

[1]仇廣翠, 孫明忠, 金浩. 220株金黃色葡萄球菌的臨床分布特點及耐藥性分析[J]. 中國實驗診斷學, 2016, 20(2): 269-271.

[2]KUMARI J, SHENOY S M, BALIGA S, et al. Healthcareassociated methicillin-resistant staphylococcus aureus: Clinical characteristics and antibiotic resistance profile with emphasis on macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance[J]. Sultan Qaboos UnⅣ Med J, 2016, 16(2): 175-181.

[3]ZHANG K, MCCLURE J A, ELSAYED S. Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant staphylococcus aureus[J]. J Clin Microbiol,2005, 43(10): 5026-5033.

[4]ENRIGHT M C, ROBINSON A, RANDLE G, et al. The evolutionary history of methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(11): 7687-7692.

[5]FEIL E J, NICKERSON E K, CHANTRATITA N, et al. Rapid detection of the pandemic methicillin-resistant staphylococcus aureus clone st 239, A dominant strain in asian hospitals[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(4): 1520-1522.

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[7]孫麗媛, 武昕媛, 李鈺, 等. ICU耐甲氧西林金黃色葡萄球菌SCCmec基因分型及耐藥性研究[J]. 中國抗生素雜志, 2015,13(10): 468-471.

[8]金春梅, 陳宏斌, 樸美花, 等. 我國延邊地區金黃色葡萄球菌分子特征研究[J]. 中國感染與化療雜志, 2014, 13(5): 468-471.