高海拔地區藏族乳腺浸潤性導管癌凋亡相關蛋白的表達及凋亡指數的研究*

贊梅，劉五甲，韓靜綺，楊娟，白麗艷，張文彥，杜尕金措，祁玉娟

（1.青海省人民醫院,青海 西寧 810007；2.青海大學，青海 西寧 810016；3.青海大學附屬醫院，青海 西寧 810001）

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一，浸潤性導管癌為乳腺癌最常見病理類型，研究[1]表明乳腺癌的發病既涉及多種危險因素又涉及多種分子機制，凋亡相關基因調控異常是乳腺癌發病重要原因之一。B細胞淋巴瘤/白血病基因-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）是凋亡抑制基因，Bax是一種凋亡促進因子，細胞凋亡是通過激活特定的蛋白酶-半胱天冬酶（Caspase）來介導的，Caspase是細胞凋亡的效應器，它可以和許多底物起作用，導致凋亡細胞發生特有的生化和形態學改變[2]。凋亡異常是許多惡性腫瘤的生物學特征，腫瘤組織凋亡指數（apoptotic index，AI）的研究對判斷腫瘤的發生、發展以及預后有重要作用[3]。關于乳腺癌Bcl-2、Bax和Caspase 3表達及AI與預后的相關性研究已多有報道，然而關于藏族乳腺浸潤性導管癌凋亡機制的研究未見報道。青海是以藏族、回族及蒙古族為主的少數民族集聚地區，本研究通過免疫組織化學方法研究世居藏族乳腺浸潤性導管癌和乳腺良性病變（乳腺纖維瘤）Bcl-2、Bax和Caspase 3及凋亡指數的表達，探討世居藏族乳腺浸潤性導管癌病因及凋亡機制。

1　資料與方法

1.1　一般資料

研究對象為2012年12月-2015年12月接受手術治療的青海地區世居藏族乳腺浸潤性導管癌和藏族乳腺良性病變（乳腺纖維瘤）患者各60例。臨床分期按國際抗癌聯盟2010第7版TNM分期，T為腫瘤的大小，N為淋巴結轉移，M為遠處轉移情況。根據Bloom-Richardson系統方案為乳腺癌組織學分級標準。所有患者均為世居藏族婦女，生活在海拔2 200 m以上。所有研究對象均對實驗知情同意，并簽署了知情同意書，并經醫院倫理委員會批準。

1.2　試劑與儀器

Caspase 3、Bax兔抗人單克隆抗體（北京中山生物技術有限公司），Bcl-2鼠抗人單克隆抗體（丹麥DAKO公司），DAKO ChemMate EnVision檢測系統K500711檢測試劑盒進行免疫組織化學實驗，TUNEL選用羅氏診斷試劑盒In situ cell death detection kit-POD。

SHANDON PATHCENTRE全自動密封式脫水機、MICROM石蠟包埋機、切片機MICROM HM340E、電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9075A）、孵育濕盒、MICROM HMS760X染色機（德國美康公司），顯微鏡BX43（日本奧林巴斯公司）。

1.3　方法

1.3.1標本收集及處理選取手術切除的新鮮乳腺浸潤性導管癌和乳腺纖維瘤標本，取組織中心塊，10%中性甲醛溶液固定，行HE染色、免疫組織化學染色和AI研究。

1.3.2HE染色將已固定組織標本經梯度脫水、浸蠟、包埋后，以4μm厚連續切片，常規HE染色。

1.3.3免疫組織化學染色采用免疫組織化學法，檢測乳腺浸潤性導管癌及乳腺纖維瘤組織Bcl-2、Bax、Caspase 3的表達。組織切片經高壓處理，修復暴露抗原。每批染色均設陽性和陰性對照，以已知陽性切片作陽性對照，以BPS代替一抗作空白對照，嚴格按照試劑盒說明書操作，DAB顯色；蘇木素輕度復染；脫水，透明，中性樹脂封片；顯微鏡觀察。

1.3.4凋亡指數研究凋亡細胞的檢測采用原位DNA缺口末端標記（terminal deoxynucleotidy transferase-mediated digoxigenin-11-dUTP nick end labeling，TUNEL）法。嚴格按照TUNEL試劑盒說明書進行制作石蠟切片→脫蠟、水化→細胞通透→加TUNEL反應液→加converter-POD→與底物DAB反應顯色→光學顯微鏡計數并拍照，分析結果；同時實驗設定陰性對照及陽性對照。

1.4　結果判定

顯微鏡下每個40倍視野至少有200個可用于評價的細胞。所有玻片評分是采用既可反映染色強度又可反映陽性細胞數的半定量方法。染色陰性：0無目標細胞染色；染色陽性：+，1%～25%細胞染色；++，26%～50%細胞染色；+++，51%～75%細胞染色；++++，75%細胞染色；按染色的強度，弱染色：×40物鏡視野才能看到細胞染色；強染色：在×4或×10物鏡視野能看到的細胞染色；中等染色：介于強與弱之間的染色。細胞凋亡陽性的判斷：以腫瘤細胞核內光鏡下觀察，陽性細胞的胞核為棕黃色，呈均勻染色或顆粒狀。AI的測定：根據切片染色強度及腫瘤細胞中陽性細胞所占的百分比。

1.5　統計學方法

采用SPSS17.0軟件進行統計分析，組間比較采用χ2檢驗、Fisher精確概率法，采用配對χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　乳腺浸潤性導管癌Bcl-2、Bax及Caspase 3的染色情況

Bcl-2染色陽性物質主要定位于細胞漿和細胞膜，Caspase 3和Bax染色陽性物質主要定位于細胞漿和細胞核。見圖1。

2.2　乳腺浸潤性導管癌TUNEL的染色情況

通過光學顯微鏡或電子顯微鏡對原位凋亡細胞進行觀察被認為是金標準。凋亡細胞在形態學上表現為染色質凝聚、細胞核崩解、核膜消失，細胞皺縮、碎裂，凋亡小體形成等。見圖2。

2.3　乳腺浸潤性導管癌及乳腺纖維瘤中Bcl-2、Bax和Caspase 3的表達

Bcl-2、Bax及Caspase 3蛋白在乳腺浸潤性導管癌及乳腺纖維瘤中的表達分別為51.7%（31/60）、76.7%（46/60）、60.0%（36/60） 和 81.7%（49/60）、85.0%（51/60）、80.0%（48/60），乳腺纖維瘤組織Bcl-2、Caspase 3蛋白表達與乳腺浸潤性導管癌組織比較，差異有統計學意義（P＜0.05），乳腺纖維瘤組織高于乳腺浸潤性導管癌組織。見表1。

圖1　乳腺浸潤性導管癌中Bcl-2、Bax、Caspase 3的陽性表達 （免疫組織化學染色）

圖2　乳腺浸潤性導管癌細胞形態 （TUNEL染色）

2.4　乳腺浸潤性導管癌Bcl-2、Bax和Caspase 3蛋白表達與臨床病理特征

乳腺浸潤性導管癌Bcl-2蛋白的表達與淋巴結轉移、ER表達相關（P＜0.05），與年齡、腫瘤直徑、組織學分級、TNM分期、PR表達、Ki67及c-erbB-2表達無關（P＞0.05）；Bax蛋白的表達與年齡、腫瘤直徑、組織學分級、TNM分期、淋巴結轉移、ER及 PR、Ki67及 c-erbB-2表 達 均 無 關（P＞0.05）；Caspase 3的蛋白表達與ER相關（P＜0.05），與年齡、腫瘤直徑、組織學分級、淋巴結轉移、TNM分期、PR、Ki67及c-erbB-2表達無關（P＞0.05）。見表2。

2.5　乳腺浸潤性導管癌Bcl-2、Bax和Caspase 3之間的關系

對60例乳腺浸潤性導管癌Bcl-2、Bax和Caspase 3蛋白的表達進行相關性分析，結果顯示，乳腺浸潤性導管癌中Bcl-2與Bax、Caspase 3的蛋白表達相關（P＜0.05）。見表 3。

表1 乳腺浸潤性導管癌與乳腺纖維瘤Bcl-2、Bax、Caspase 3蛋白的表達 [n =60，例（%）]

表2　乳腺浸潤性導管癌Bcl-2、Bax、Caspase 3的蛋白表達與臨床特征

續表2

表3　乳腺浸潤性導管癌Bcl-2與Caspase 3的相關性分析

2.6　乳腺浸潤性導管癌與乳腺纖維瘤AI比較

乳腺浸潤性導管癌AI陽性率與乳腺纖維瘤比較，差異有統計學意義（P＜0.05），乳腺浸潤性導管癌AI陽性率低于乳腺纖維瘤。見表4。

表4　乳腺浸潤性導管癌與乳腺纖維瘤凋亡指數 [n =60，例（%）]

2.7　乳腺浸潤性導管癌AI與臨床病理特征

乳腺浸潤性導管癌AI與腫瘤直徑、TNM分期、PR表達相關（P＜0.05），與年齡、淋巴結轉移、組織學分級、ER表達、Ki67及c-erbB-2表達無關（P＞0.05）。見表 5。

表5　乳腺浸潤性導管癌AI與臨床病理特征

續表5

2.8　乳腺浸潤性導管癌AI與Bcl-2、Bax和Caspase 3的相關性

對乳腺浸潤性導管癌AI與Bcl-2、Bax和Caspase 3蛋白的表達進行相關性分析，結果顯示，乳腺浸潤性導管癌AI與Bcl-2、Bax、Caspase 3的蛋白表達無關（P＞0.05）。見表 6。

表6　乳腺浸潤性導管癌Bcl-2、Bax、Caspase3的表達與AI相關性分析 例（%）

3　討論

藏族是世居青藏高原的獨特民族，由于居住區域偏遠，預防、保健知識普及率低，乳腺癌診斷后分期偏晚，預后差。筆者對乳腺癌的前期研究發現[4]，缺氧可以對腫瘤增殖和轉移有較強的促進作用，改善缺氧信號通路可以抑制腫瘤的增殖和遷徙，青海地區的高寒、缺氧環境，以及藏族族內通婚習俗，加之世代居住高原地區的環境特點與高原特殊民族乳腺癌的發病機制迫切需要研究。

凋亡在腫瘤的發生、發展中扮演重要的角色，腫瘤的發生過程中機體對于凋亡的調節發生紊亂，導致凋亡促進因子與抑制凋亡因子之間平衡打破，造成腫瘤細胞的惡性增殖。Bcl-2基因是一種原癌基因，最初是在非霍奇金濾泡性淋巴瘤t（14，18）染色體易位的斷點上被發現的；主要存在于線粒體膜、滑面內質網和核膜上，通過穩定膜蛋白和減少細胞膜的通透性，抑制CytC、Caspase等凋亡誘導因子的釋放。Bcl-2家族蛋白對線粒體的凋亡起重要調控的作用[5]，包括抑制和促進細胞凋亡兩類功能相反的蛋白質。Bax是1993年由OLTVAI等[6]在人和鼠B細胞中發現的與Bcl-2共沉淀的一種促凋亡蛋白，位于染色體19q13.3～9q13.4。Bcl-2和Bax是Bcl-2蛋白家族重要成員，Bcl-2蛋白能阻止由多種因素誘導的細胞凋亡，與凋亡促進基因Bax拮抗，抑制細胞色素C自線粒體釋放至胞質，阻止胞質細胞色素C對Caspase 3的激活。

Bcl-2蛋白功能失調是乳腺癌形成的1個重要機制。國外研究報道[7]Bcl-2在浸潤性乳腺癌中的表達率為60%～80%，張印春等[8]報道天津平原地區乳腺癌浸潤性導管癌及其癌旁組織中的Bcl-2、Bax表達率分別為78.8%、74.1%和58.8%、67.1%，差異有統計學意義。陳建生[9]等研究重慶地區Bcl-2在乳腺纖維瘤及乳腺癌的表達分別為80%及61.25%，Bcl-2在乳腺癌組織學分級Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級中表達陽性率分別為84.61%，58.69%，12.5%，差異有統計學意義。本研究發現藏族乳腺癌和藏族纖維瘤Bcl-2、Bax和Caspase 3的表達率分別為52.2%、76.7%、60.0%和81.7%、85.0%、80.0%，藏族乳腺纖維瘤組織Bcl-2、Caspase 3蛋白表達高于藏族乳腺癌組織，差異有統計學意義，與部分平原地區的研究報道一致。研究報道浸潤性乳腺癌中Bcl-2的表達和雌、孕激素受體的表達水平呈正相關，與表皮生長因子受體、c-erbB-2、P53呈負相關[10]。姜楠[11]等在北京地區婦女乳腺癌的研究顯示Bcl-2的表達為82.7%，與年齡、絕經狀況和腫瘤位置有關。本研究中藏族乳腺浸潤性導管癌Bcl-2的表達與淋巴結轉移負相關、ER陽性表達相關，與年齡、腫瘤大小、分期、組織學分級、ki-67及c-erbB-2表達無相關性。

CHANDRIKA等[12]研究發現，相比定位于線粒體外膜上的Bcl-2蛋白，內質網膜上的Bcl-2主要靠熱休克蛋白27磷酸化的增強及抑制死亡酶（Caspase 9）活性延長細胞存活期。所以Bcl-2表達調節機制復雜，不僅與染色體易位有關，而且雌激素、COX2、BP1、E-鈣黏蛋白、EGFR等多種因素可能參與其中。龐雪利等[13]研究認為，乳腺癌MCF-7細胞中IL-8受體CXC趨化因子受體CXCR1、CXCR2均有表達；IL-8抑制MCF-7細胞凋亡的機制可能與IL-8激活PI3K/AKT信號通路而上調Bcl-2、下調Caspase-3的表達有關。所以筆者考慮在下一步的研究中擴大樣本驗證結果，對Bcl-2的表達在三陰和非三陰乳腺癌分層分析，同時需要考慮Bcl-2的表達與以上多種因素的相關性，當然更要思考藏族乳腺浸潤性導管癌的發生機制與長期的高原缺氧環境其凋亡機制、腫瘤微環境與平原地區發病是否有所不同。

細胞凋亡是通過激活特定的Caspase來介導的。Caspase是細胞凋亡的效應器，它可以和許多底物起作用，導致凋亡細胞發生特有的生化和形態學改變，包括線粒體外膜通透性的改變、細胞骨架重排、磷酸酰絲氨酸的暴露和DNA斷裂等[14]。王進京等[15]對天津婦女乳腺癌研究發現，Caspase 3蛋白在乳腺浸潤性導管癌、導管內癌、增生癥中的表達均高于癌旁組織，Caspase 3蛋白的表達與腫瘤的大小、淋巴結轉移數目、患者年齡均無統計學意義。本研究發現，Caspase 3蛋白在乳腺纖維瘤組織表達高于乳腺浸潤性導管癌組織，差異有統計學意義，Caspase 3的表達與ER陽性表達正相關，Bcl-2與Bax、Caspase 3的表達相關。藏族乳腺浸潤性導管癌組織中AI陽性率低于乳腺纖維瘤，且AI與腫瘤直徑、TNM分期、PR表達相關，魏瓊英[16]等研究報道非小細胞肺癌組織AI低于癌旁肺組織且與淋巴結轉移相關。

乳腺癌是個復雜的疾病，涉及到多種分子間調控的異常，本研究結合地區的特殊自然環境和人群特點，通過青海地區世居藏族乳腺浸潤性導管癌及乳腺良性病變的研究，為探討少數民族乳腺癌的發病機制研究、評估預后、靶向治療和個體化治療方案的制定奠定理論基礎。

參 考 文 獻：

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