一種HBV DNA定量檢測試劑的準確性分析

孔祥沙，楊瑞鋒，季穎，朱凌，張海瑩，王震宇，魏來

[北京大學人民醫院（北京大學肝病研究所），北京 100044]

HBV DNA是反映乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）復制比較直接和可靠的指標[1]。定量檢測血清或血漿中HBV DNA可作為急性或慢性HBV感染的診斷以及初始治療方案制定的依據，其動態變化又可作為抗病毒療效監測以及抗藥性是否形成的重要指標[2]。同國際主流試劑相比，國產試劑在檢測的敏感性和精密性上尚有較大差距[3]。羅氏公司生產的“Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HBV Test”（Cobas Taqman HBV V2.0）檢測系統采用全自動化操作，由于具有較高的敏感性、精確性、可重復性和較寬的檢測范圍而獲得美國FDA批準[2，4-5]。而careHBV PCR Assay是臨床應用較廣泛的一種國產HBV DNA定量檢測試劑，其第3代試劑產品（careHBV PCR Assay V3.0）相對之前產品改進了純化技術，增加了檢測用量，提高了敏感性和線性范圍。本文以羅氏公司的Cobas Taqman HBV V2.0為參比試劑，評價careHBV PCR Assay V3.0試劑檢測的準確性。

1　資料與方法

1.1　標本來源

收集2015年1～11月北京大學人民醫院收治的HBV感染者的血清標本93份。所有患者均符合慢性乙型肝炎防治指南（2010）標準[6]：既往有乙型肝炎病史或HBsAg陽性超過6個月，現HBsAg和（或）HBV DNA仍為陽性者，可診斷為慢性HBV感染。該部分患者血清HBV DNA經Cobas Taqman HBV V2.0檢測均為陽性，并且涵蓋了HBV DNA載量的高、中、低值。同期收集健康體檢者血清標本30份。所有標本-20℃冷凍保存。

1.2　主要試劑及儀器

主要試劑：第3代HBV DNA WHO國際標準品（購自英國國家生物制品檢定所，編號：10/264，濃度賦值8.5×105IU/ml），稀釋用陰性血清為HBsAg、抗-HCV、抗-HIV均為陰性的人AB型血清（天津川貝公司），careHBV PCR Assay V3.0試劑盒（深圳凱杰公司，檢測上下限為 30×108～ 1.1×108IU/ml），Cobas TaqMan HBV V2.0試劑盒（德國羅氏診斷公司，檢測上下限為20×108～ 1.7×108IU/ml），巢式 PCR 所用的 dNTP、Taq DNA Polymerase、PCR buffer和引物（美國賽默飛世爾公司）。主要儀器：LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀（德國羅氏診斷公司），Cobas AmploPrep/Cobas TaqMan 96型自動提取及擴增儀器（德國羅氏診斷公司），巢式PCR使用Mastercycler PCR儀擴增，Bio-Rad電泳儀以及凝膠成像儀鑒定PCR產物。

1.3　WHO標準品檢測

用不含核糖核酸酶的滅菌雙蒸水將HBV DNA WHO國際標準品配制成6份不同梯度濃度的樣本，分 別 為 8.5×105、8.5×104、8.5×103、8.5×102、85及42.5 IU/ml。用careHBV PCR Assay V3.0定量檢測HBV DNA載量，每份樣本重復檢測3次，計算均值。

1.4　臨床標本檢測

用careHBV PCR Assay V3.0和Cobas Taqman HBV V2.0同時對收集的93份HBV感染者標本和30份健康者標本進行HBV DNA定量檢測。對于超出試劑盒檢測上限的標本，使用HBV陰性人血清將原始標本稀釋后重復檢測，用所得結果乘以稀釋倍數進行校正。

1.5　HBV DNA基因型的測定

采用巢式PCR擴增漏檢陽性標本中的HBV S區[7]，巢式PCR外引物正向：5'-AGGACCCCTGCTCGT GTTAC-3'，反向：5'-ACATACTTTCCAATCAATAG-3'；內引物正向：5'-GATGTGTCTGCGGCGTTTTATCAT-3'，反向 ：5'-ACATATCCCATGAAGTTAAG-3'。兩輪PCR 循環參數相同，94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 45 s，共35個循環；72℃ 7 min。制備12 g/L瓊脂糖凝膠電泳用于鑒定PCR產物。將符合標準的PCR產物送往北京諾賽公司測序，并與標準序列比對，從而判斷其基因型。

1.6　統計學方法

所有數據采用SPSS 19.0軟件分析，所有圖形采用軟件GrapPad Prism 5繪制。將HBV DNA載量換算成對數形式（Log10IU/ml）進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示。兩組數據進行Pearson相關分析，比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　careHBV PCR Assay V3.0檢測WHO國際標準品的結果

對用careHBV PCR Assay V3.0檢測配制的6份不同梯度濃度WHO HBV DNA國際標準品的結果與標準品理論值進行相關性分析，兩者存在線性相關（R2=0.993，P=0.000）。見圖 1。

2.2　2種試劑HBV DNA檢測結果的相關性分析

Cobas Taqman HBV V2.0檢測HBV DNA結果陽性的93份標本中，careHBV PCR Assay V3.0檢測68份陽性，25份陰性。將2種試劑檢測結果均陽性的68份標本進行相關性分析，結果呈線性相關（R2=0.947，P=0.000）。見圖 2。

2.3　2種試劑HBV DNA檢測結果的一致性分析

將2種試劑HBV DNA檢測結果均陽性的68份標本進行一致性分析。數據顯示95%一致性界限以外有2份標本（3.22%）；一致性界限范圍內，Cobas Taqman HBV V2.0與careHBV PCR Assay V3.0 HBV DNA檢測結果的對數均值分別為（5.09±2.14）Log10IU/ml和（4.63±2.32）Log10IU/ml，經配對t檢驗，2種試劑HBV DNA檢測結果差異無統計學意義（t=1.204，P=0.231）。2種檢測試劑對30份健康體檢者標本的檢測結果均為陰性。見圖3。

2.4　漏檢標本分析及基因型檢測

careHBV PCR Assay V3.0檢測陰性的25份標本中，其中11份標本Cobas Taqman HBV V2.0檢測結果＜30 IU/ml（careHBV PCR Assay V3.0檢測下限）；而其余14份標本則為漏檢。漏檢標本中13份Cobas Taqman HBV V2.0檢測結果位于30～2 000 IU/ml間；1份＞2 000 IU/ml。采用巢式PCR擴增漏檢標本的HBV S區，直接測序法測定基因型，其中1份標本經Cobas Taqman HBV V2.0檢測HBV DNA結果為（7.79×102IU/ml）為C型基因型，其測序結果見圖4。其他漏檢標本因標本量不足或病毒載量較低等原因未能成功檢測其基因型。

圖1　WHO國際標準品結果

圖2　2種試劑HBV DNA檢測結果的相關性分析

圖3　2種試劑HBV DNA檢測結果的一致性分析

圖4　漏檢標本的測序結果

3　討論

目前定量檢測HBV DNA的方法很多，文獻報道國產試劑與進口試劑有較好的相關性，比如凱杰試劑和美國Digene公司生產的Hybrid Capture-Ⅱ HBV DNA試劑[8]、國產實時熒光定量試劑和Cobas Taqman HBV V2.0[9]、以及 careHBV PCR Assay V2.0 和 Cobas Taqman HBV V1.0[10]等都有良好的相關性。本研究采用改良后的careHBV PCR Assay V3.0與Cobas Taqman HBV V2.0進行比較，結果顯示careHBV PCR Assay V3.0與Cobas Taqman HBV V2.0具有良好的相關性。careHBV PCR Assay V3.0檢測HBV DNA WHO國際標準品的實測值與理論值存在線性相關，且能檢測到WHO國際標準品濃度為42.5 IU/mL的標本。但是，在分析2種試劑檢測陽性標本的一致性時，盡管兩組檢測結果差異無統計學意義，但careHBV PCR Assay V3.0檢測結果稍低于Cobas Taqman HBV V2.0檢測結果均值，提示careHBV PCR Assay V3.0盡管具有較好的線性范圍和較高的敏感性，但是其檢測的準確性尚與Cobas Taqman HBV V2.0存在差距。

本研究檢測結果發現，小于careHBV PCR Assay V3.0檢測下限（30 IU/ml）的11份標本未檢出。在低病毒載量（30～2 000 IU/ml）標本中，careHBV PCR Assay V3.0檢測結果的漏檢率，提示careHBV PCR Assay V3.0檢測HBV DNA低病毒載量的敏感性比Cobas Taqman HBV V2.0低。表明用careHBV PCR Assay V3.0檢測結果為陰性時，其實很多病例并非真正完全清除病毒，而是由于其檢測系統分析敏感性不足，尚不能檢出殘留的HBV DNA，還需進一步提高敏感性。在careHBV PCR Assay V3.0試劑漏檢的樣本中有1份標本基因型為C型，由此可見careHBV PCR Assay V3.0對基因型為C型的HBV DNA檢測可能存在漏檢。當然，由于樣本數量少，尚需進一步增加樣本量驗證。

國內研究[11]也證實了國產試劑與進口試劑存在差距，研究采用德國Qiagen公司的Anus HBV DNA熒光定量PCR試劑和國內生產的3種HBV DNA熒光定量PCR試劑，對HBV感染者的血清標本進行平行檢測，并將結果按不同HBV DNA拷貝水平進行分組分析，研究發現不同試劑對高病毒載量標本的檢測結果差異無統計學意義，而病毒載量低的標本則差異有統計學意義，且在低拷貝樣本中，凱杰試劑與Anus試劑的檢測結果相關性極差，且出現明顯的漏檢率。因此很多慢性乙型肝炎患者在抗病毒治療過程中，以及低病毒載量的患者，國產試劑就不能很好地監測病毒載量的變化，也不能很好地指導治療，以及判斷停藥的終點。

careHBV PCR Assay V3.0雖然通過改進純化技術，加入磁珠，加入內標，增加標本用量，提高了檢測的敏感性，增寬了檢測線性范圍，但是與實現全自動化檢測與分析的Cobas Taqman HBV V2.0相比，仍有待進一步提高。

參 考 文 獻：

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[2]CHEVALIEZ S, BOUVIER-ALIAS M, LAPERCHE S, et al.Performance of the Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan real-time PCR assay for hepatitis B virus DNA quantification[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(5): 1716-1723.

[3]楊瑞鋒, 魏來. 乙型和丙型肝炎病毒核酸檢測技術及進展[J].中華檢驗醫學雜志, 2010, 33(5): 476-480.

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