體外受精-胚胎移植超促排卵周期中金屬蛋白酶3、腫瘤壞死因子、血管內皮生長因子的表達與卵巢反應性的研究*

金銳，包俊華，趙亞瓊，劉芳，唐大偉，白剛，劉麗麗，趙靜

（寧夏銀川市婦幼保健院，寧夏 銀川 750001）

隨著人類輔助生殖技術的廣泛開展和超促排卵藥物的普遍使用，卵巢的不同反應所致的各種并發癥日益引起臨床醫師的重視，評估在超促排卵過程中的卵巢微環境對卵巢反應性的影響[1]，了解卵巢微環境的變化，幫助臨床醫師合理使用超促排卵藥物，改善促排周期的妊娠情況。本文著重分析探討在控制性超排卵治療周期中，在使用大劑量的促排卵藥物后，不孕婦女的血清及卵泡液中金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）的表達差異，分析MMP-3、VEGF及TNF與卵巢反應性的關系。

1　資料與方法

1.1　一般資料

選擇2013年3月-2015年10月在銀川市婦幼保健院生殖中心行體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET） 治 療， 年 齡22～38歲，月經規律，排卵正常，排除子宮內膜異位癥及反復流產病史，且配偶精液檢驗正常（世界衛生組織第五版分析標準），均采用黃體期長方案的413例周期不孕婦女。收集這部分患者在使用促性腺激素（Gonadotrophin，Gn）啟動日和絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）注射日的血清標本，并在患者取卵時收集其卵泡液。根據患者獲卵數分為3個組：獲卵數≥20個的為高反應組，獲卵數在6～19個的為正常反應組，獲卵數≤5個的為低反應組。

1.2　方法

1.2.1控制性超排卵方案 采用黃體期長方案。治療前1周期的黃體中期肌內注射（肌注）長效GnRHa（曲普瑞林，1.0 mg/支，德國輝凌制藥有限公司），達到垂體降調節標準（FSG、LH均＜5 IU/L，E2＜50 ng/L，子宮內膜厚度＜5 mm，雙側卵巢無囊腫）后，在月經3～5 d 時肌內注射（肌注）Gn。經陰道B超監測卵泡的生長，待雙側卵巢中有2個卵泡平均直徑＞19 mm時，患者停止使用Gn，改為肌注hCG，將此日設定為hCG日；在使用hCG 34～36 h后患者在陰道B超的引導下抽取卵泡液，將卵泡液送至實驗室并在顯微鏡下撿拾卵子。

1.2.2卵子的受精及胚胎培養將抽吸卵泡液獲得的卵子移入濃度為6%二氧化碳CO2培養箱中培養2～4 h，與優化的精子結合，形成受精卵后將其移入胚胎培養試劑中繼續在體外培養3～5 d，并對形成的胚胎進行評估打分。胚胎形態學評分標準為：1分：胚胎卵裂球大小如碎片一般，不一致，不對稱，無核碎片＞50%，胞漿顆粒粗糙；2分：胚胎胞漿濃縮，質地粗糙，無核碎片占20%～50%，卵裂球大小明顯不均一；3分：胚胎胞漿飽滿，質地略有不均，無核碎片10%～20%，卵裂球大小輕度不對稱，不一致；4分：胚胎胞漿飽滿，質地均勻，無核碎片≤5%，卵裂球大小均一，對稱。在取卵后第3天對具有移植指針的患者選擇評分在3～4分的優質胚胎1～3個進行子宮腔內移植。

1.2.3患者的黃體支持及妊娠確認移植術后對患者采用肌注或口服黃體酮進行黃體支持，14 d后檢測患者血清及尿液hCG，確認是否妊娠。14 d后患者行B超檢查，如子宮內見妊娠囊、胎芽及胎心搏動可確診為臨床妊娠。

患者的卵子受精及胚胎培養用瑞典Vitrolife 公司生產的G5系列培養液進行。所用的培養皿為美國FLCON公司生產的型號為3037、3003及3066培養皿。

VEGF、TNF及MMP-3的檢測采用定量酶聯免疫法。采用雙抗體夾心酶聯米易吸附測定方法測定卵泡液和血清中的VEGF、TNF及MMP-3水平。試劑盒購自美國R&D公司。實驗操作按試劑盒說明書進行。批次和批間差異＜10%。

1.2.5儀器與設備培養患者卵子和胚胎的培養箱為日本三洋CO2培養箱。采用美國熱點Thermo MK3系列酶標儀進行測量血清及卵泡液中的MMP-3、VEGF及TNF。

1.3　統計學方法

采用SPSS 13.5統計學軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間采用方差分析，在方差分析有意義的基礎上，行LSD-t檢驗進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　患者基本資料

共納入413例周期的患者，高反應周期有119例，正常反應周期有218例，低反應周期有76例。這些患者的年齡、BMI、不孕年限組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。

2.2　患者促排卵過程血清中VEGE、TNF、MMP-3的水平變化

413個周期的患者，在超促排卵過程中，隨卵泡發育，各組患者血清中MMP-3和VEGF的水平呈上升趨勢。注射hCG日血清中MMP-3和VEGF的水平與肌注Gn日比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。注射hCG日血清中MMP-3和VEGF水平高于肌注Gn日血清的MMP-3和VEGF水平。在超促排卵過程中，隨著卵泡的發育，各組患者血清中TNF水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），Gn啟動日高于肌注hCG日。見表2。

表1　患者基本資料 （±s）

表1　患者基本資料 （±s）

高反應組（n =119）　30.34±3.80　25.14±5.10　3.78±0.31正常反應組（n =218） 31.59±4.20　28. 42±6.33　3.87±0.29低反應組（n =76）　34.41±4.44　29.29±6.21　4.62±0.39 F值　0.186　0.611　-0.112

2.3　患者卵巢反應性與卵泡液中MMP-3、VEGF及TNF水平的關系

3組患者卵泡液中MMP-3、VEGF及TNF水平比較，組間差異有統計學意義（P＜0.05）。高反應患者卵泡液中MMP-3水平高于正常反應組和低反應組患者。而卵泡液中VEGF和TNF的水平恰恰相反，高反應組患者的水平低于正常反應組和低反應患者的水平。見表3。

①建設項目節水管理需要建立建設項目實施全過程的管理制度。一是規劃階段，發展改革主管部門組織對建設項目設計任務書進行審查時，同時審查節水設施可行性情況；二是設計階段，建設單位需要提交節水評估報告，節水管理機構需要對建設項目施工圖設計節水設施的情況同步審查；三是施工階段，施工單位需要按照施工圖設計文件，進行節水設施施工；四是竣工驗收階段，節水管理機構應對節水設施進行同步竣工驗收，驗收合格后通知水行政主管部門，允許建設項目取水或在管網范圍內向建設項目供水；五是運行管理階段，建設單位必須確保已經建成節水設施的正常運行，節水管理機構或水行政主管部門對節水設施運行維護情況進行監管、處罰。

表2　各組患者血清MMP-3、TNF、VEGF注射Gn及注射hCG日血清水平比較 （±s）

表2　各組患者血清MMP-3、TNF、VEGF注射Gn及注射hCG日血清水平比較 （±s）

MMP-3/（ng/ml）　VEGF/（mg/L）　TNF/（pg/ml）Gn日　hCG日　Gn日　hCG日　Gn日　hCG日高反應組（n =119）　25.16±9.23　53.16±7.89　523.34±46.89　1 543.45±124.56　39.23±4.09　26.56±2.34正常反應組（n =218）　23.34±6.14　23.47±6.24　467.23±23.56　1 324.34±107.69　42.34±6.26　30.24±3.23低反應組（n =76）　18.19±4.26　18.29±4.19　356.24±18.79　1 108.34±109.45　47.18±3.42　32.13±4.32 F值　1.610　1.820　0.590　0.490　0.910　0.130 P值　0.006　0.004　0.002　0.019　0.040　0.002組別

表3　患者卵泡液中VEGF、TNF及MMP-3水平比較 （±s）

表3　患者卵泡液中VEGF、TNF及MMP-3水平比較 （±s）

組別　MMP-3/（ng/ml）　TNF/（pg/ml）　VEGF/（mg/L）高反應組（n =119）　55.02±10.14　47.6±4.23　1 844.19±331.32正常反應組（n =218）　38.89±7.23　50.7±5.45　1 608.53±328.22低反應組（n =76）　29.19±5.03　51.99±3.25　2 270.39±234.19 F值　0.141　0.781　0.207 P值　0.011　0.000　0.010

3　討論

卵泡液是卵巢中卵子及顆粒細胞生長發育的微環境。卵泡液是由卵巢局部分泌物和血漿的滲出物共同組成的，在卵子的生長、發育、排出、閉鎖中起至關重要的調控作用[2]。在IVF-ET的超促排卵過程中，在外源性促性腺激素的作用下，卵泡內的細胞分泌不同的細胞因子形成復雜的網絡體系，協同發揮生物活性功能[3]，直接或間接地影響著卵母細胞的發育、分裂、生存及以后的受精、胚胎形成及著床[4]。

MMPs家族是1個大家族，目前已分離鑒別出20個成員，編號分別為MMP 1～20，它們是一組鋅離子依賴性肽鏈內切酶，大小各異，底物不盡相同，能裂解維系蛋白結構的肽鏈，主要參與結締組織的降解[5]。MMPs在卵泡生長發育中的作用主要是可以精確調控在卵泡生長發育中卵巢內細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分的降解和重塑，MMPs通過調節卵巢結構成分的動態周期性變化，對卵泡和黃體功能發揮作用。在排卵過程中，包括卵泡生長和卵泡破裂釋放出成熟的卵母細胞以及顆粒細胞的黃素化，這些都涉及到廣泛的血管發生和卵巢組織重建[6]。迄今為止，已經發現有多種MMPs參與了卵泡生長和排卵的過程。本研究測定分析了在控制性排卵過程中，卵巢高反應的患者、正常反應患者以及卵巢低反應患者血清及卵泡液中的MMP-3的表達，可以看到血清中MMP-3的表達隨著獲卵數目地增加而有所增加，卵巢高反映的患者有較高的MMP-3水平，與此同時妊娠的患者中MMP-3的表達較未妊娠的患者高[7]，所以，血清中MMP-3可以作為預測卵巢反應性和成功妊娠的早期指標，從而有利于臨床早期干預。

TNF是肌肉細胞源性具有多向性作用的細胞因子，主要由活化的巨噬細胞、NK細胞及T淋巴細胞產生。參與細胞的增殖和凋亡等過程與慢性乙肝、自身免疫性疾病、胰島素抵抗、腫瘤等多種疾病的易感性相關[8]。TNF在卵巢上主要由顆粒細胞和巨噬細胞產生，TNF參與排卵，但當其水平較高時可抑制顆粒細胞上胰島素樣生長因子1誘導的E2的合成和卵泡膜上LH誘導的雄烯二酮的合成，從而影響卵泡的發育[9]。在超排卵過程中，TNF水平隨著卵泡生長成熟逐漸降低，通過抑止顆粒細胞對雌二醇及孕酮的合成對促性腺激素的反應下降。與此同時TNF可以促進MMP-3的活性，促使排卵發生，同時導致排卵后的卵泡黃素化、血管化，所以當接近排卵時，在TNF的作用下卵泡液中的MMP-3和VEGF水平均呈現上升的趨勢[10]。

VEGF在維持卵巢正常功能上起重要作用，對卵泡生長、黃體分化、卵母細胞的成熟及受精是十分重要的[11]。在卵泡生長的過程中，卵泡液中的VEGF誘導卵泡周圍的微血管形成，促進血液中的FSH和LH更好地作用于卵母細胞，從而促進了卵母細胞的生長和成熟[12]。同時卵巢中的顆粒細胞中VEGF的表達受促性腺激素和TNF等因子的調節，在卵泡期增加其通透性，促進卵泡液聚集，利用前體物質如脂質的運輸[13]，為激素的合成提供條件。在控制性超促排卵過程中，顆粒細胞、卵泡膜細胞分泌的VEGF促使卵泡周圍的微血管生成，從而使得卵泡有機會獲得更多的激素或營養物質，進而促進卵泡的發育[14]。

血清中的MMP-3、TNF及VEGF等只是眾多卵巢卵泡發育微循環中的一員，對于各個因子的相互調節，互相平衡[15]，需要更進一步地研究。分析卵泡液中的細胞因子的變化可以作為IVF-ET過程中一個輔助檢查部分，幫助臨床醫師更好地指導臨床用藥，改善IVF-ET中超促排卵中卵子發育的情況，提高獲得卵母細胞質量，進而提高IVF-ET的妊娠結局。

參 考 文 獻：

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