一種新型磁性熒光納米材料的制備與應用分析

張廣琴, 張　洪, 王　麗

(武漢大學人民醫院 藥學部, 湖北, 武漢, 430060)

磁性納米材料是有磁性的納米材料，具有超順磁性、超向聚集效應、被動靶向性、可偶聯型、低毒性和良好的生物相容性，廣闊地應用于磁儲存介質、生物傳感器、醫療應用、磁性墨水噴射印花等各方面[1-5]。隨著生物醫療技術發展，以及生活水平的提高，對生物材料的要求也越來越高，單一的磁性納米材料無法實現示蹤，這很大程度限制了該材料的應用。磁性熒光納米材料是將熒光物質結合到磁性納米材料上，從而將具有靶向效應的磁學特性與具有生物標記功能的熒光性質有效結合，得到的具有磁性與熒光雙功能的納米材料，大大拓展了磁性納米材料的應用，在靶向藥物傳輸系統、磁共振成像及熒光探針等多個領域有廣闊前景[6-9]。目前研究較多的磁性熒光納米材料多是采用單一熒光物質與磁性材料結合，其熒光物質的選擇，以及材料的制備方法對該材料發光效率、發光壽命、穩定性等均有一定影響。四氧化三鐵(Fe3O4)是應用最廣泛的磁性納米材料之一，其具有可調節的納米磁性、低毒性、優越的生物相容性、以及特定的靶向性等良好性質，在醫學領域和生物技術領域，得到廣泛應用，在核磁共振成像[10], 藥物的靶向傳遞[11], 熱療[12]，蛋白的磁分離，以及可作為基因治療的載體[13]。羅丹明B與萘酰亞胺是兩種常見的熒光染料，他們的最大熒光具有相對較大差異，在同一樣品中的熒光測定干擾較小。本研究采用共沉淀法[11]制備Fe3O4納米粒，并將其結合上羅丹明B與萘酰亞胺兩個熒光團，通過兩個熒光團的熒光比率來分析其應用，現報告如下。

1　儀器與試藥

1.1　儀器

電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司, AR1104], 紫外-可見光譜儀(日本JASCO公司, V-550), pH計[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司, 320-S], 激光粒度儀(英國馬爾文儀器有限公司, Nano-ZS)。

1.2　試藥

氫氧化鈉(NaOH, 國藥集團，分析純)，磷酸二氫鈉(NaH2PO3, 國藥集團，分析純)，鹽酸(HCl, 國藥集團，分析純)，聚丙烯酸(PAA, 分子量約2.6萬，河南凱特化工有限公司)，羅丹明B(C28H31ClN2O3, 國藥集團，分析純)，聚乙烯亞胺(PEI, 分子量約2000, 上海瀚思有限公司)，六水三氯化鐵(FeCl3·6H2O, 國藥集團，分析純)，鐵粉(Fe, 國藥集團，分析純)，二環己基碳亞胺(DCC, 阿拉丁公司，分析純), N-丁基-4-乙二胺基-1, 8-萘酰亞胺(C19H21N3O2, 實驗室合成，化學純)，四氫呋喃(C4H8O, 國藥集團，分析純)，實驗用水為電阻率大于18MΩ·cm的超純水。

1.3　實驗方法

1.3.1磁性熒光納米粒(Fe3O4@PEI@RN)的制備: 磁性熒光納米粒(Fe3O4@PEI@RN)的制備路線分3步進行: ① Fe3O4納米粒的制備: 準確稱取10.812 g FeCl3·6H2O, 用25 mL蒸餾水溶解，并通氮氣除氧，加入0.280 g鐵在氮氣保護下充分反應，反應得到Fe3+: Fe2+=2∶1 混合溶液。在強力攪拌、30 ℃恒溫水浴下，將該混合溶液緩慢滴入500 mL 1.5 mol/L的NaOH 溶液中，調節pH值11～12, 然后60 ℃恒溫水浴陳化1 h, 得到黑色沉淀。將該混合液用磁鐵吸附沉淀，棄去上清液，并用去氧水洗滌三次，磁分離的到沉淀物。最后用500 mL 0.01 mol/L 的HCl 溶液加入到制得的沉淀中，中和掉粒子表面所帶的負電荷至溶液呈中性，強磁分離，即制得Fe3O4磁性納米顆粒。② PEI包覆: 取適量Fe3O4溶于50 mL蒸餾水中，超聲15 min 使其分散，緩慢加入50 mg聚乙酰亞胺攪拌，慢速攪拌充分均勻后，移至恒溫水浴繼續慢速攪拌反應24 h, 水溫30 ℃。反應結束后，強磁分離，固體用蒸餾水和乙醇分別洗滌3次，即得PEI修飾的Fe3O4磁性納米粒。③ 磁性熒光納米粒(Fe3O4@PEI@RN)的構建: 取聚丙烯酸433 mg溶于3 mL四氫呋喃中，加入31 mg 4-氨基-N-丁基-1, 8 萘酰亞胺(ABN)溶解后加入二環己基碳亞胺(DCC) 64.1 mg, 室溫攪拌反應12 h, 得到接有ABN 熒光團的聚合物分子PAN。將上一步制備的Fe3O4@PEI @RN 納米粒超聲分散于200 mL水中，并加入124 mg羅丹明B, 常溫低速攪拌下加入PAN溶液中，繼續攪拌2 h后，磁分離，并用適量蒸餾水和乙醇洗滌數次，至上清液無熒光，得到有羅丹明B和ABN兩個熒光團的Fe3O4@PEI@RN納米粒，并將其保存在水溶液中。

1.3.2Fe3O4@PEI@RN性能測試與表征: ① Fe含量測定: 采用有機濕法破壞對制備的Fe3O4@PEI@RN 進行處理，將其中的Fe3O4轉變成Fe3+, 并用鄰菲羅啉做顯色劑的標準曲線法來測定Fe3O4@PEI@RN 納米粒溶液中Fe 的含量。通過標準曲線計算得出Fe的含量。② 熒光團含量測定: 采用紫外分光光度法分別測定Fe3O4@PEI@RN中的羅丹明B熒光團和萘酰亞胺熒光團的含量。③ 粒徑測定: 將制備的納米粒溶液稀釋一定倍數后，采用動態光散射法對其進行粒徑測定。④ 熒光光譜分析: 將Fe3O4@PEI@RN 配置成一定的濃度，分別在激發波長λex=443 nm，發射波長λem=532 nm; 激發波長λex=530 nm，發射波長λem=565 nm下測定溶液的熒光光譜。

1.3.3pH值對產物熒光性能的影響: 取一定樣品，分別加入不同pH值 的緩沖液(pH值=2.0～10.0), 配置成溶液，最終得到不同pH值 的同濃度的樣品溶液。分別在激發波長λex=443 nm 與λex=530 nm 條件下測定不同pH值 的Fe3O4@PEI@RN 溶液的熒光強度I532和I565, 并計算熒光強度比值F=I532/I565。比較不同pH值的緩沖液對F 值的影響。

1.3.4干擾物對熒光性能的影響: 用pH值7.0的緩沖液配置一系列同濃度的Fe3O4@PEI@RN 溶液，并向其中加入不同的金屬離子，蛋白質或DNA, 并定容至相同體積，得到一系列含不同干擾物的Fe3O4@PEI@RN 溶液。測定各溶液分別在不同激發波長λex=443 nm 與λex=530 nm 下的熒光強度，計算光譜F, 并與不加干擾時Fe3O4@PEI@RN 溶液作對比。

2　結　果

2.1　成分測定

Fe含量測定: 將樣品稀釋5倍后的溶液，在波長λ=510 nm時的吸光度A510=0.418。標準曲線方程y=0.1816x-0.0474,R2=0.9997。通過朗伯比爾定律計算得出Fe3O4@PEI@RN溶液中Fe的濃度C=14.1 mg/mL。

熒光團含量測定: 通過在不同波長處Fe3O4@PEI@RN的吸光度值，計算出羅丹明B的濃度為7.6 mg/mL, ABN的濃度為94.8 mg/mL。

2.2　納米粒的粒徑

采用DLS儀測量了Fe3O4、Fe3O4@PEI、Fe3O4@PEI@RN共3種納米粒的粒徑，其平均粒徑分別為158、202、224 nm, 其多分散系數PDI 分別為0.515, 0.240, 0.799。制備的磁性熒光納米顆粒，粒度較小，處于納米級別，且分布較為集中。

2.3　熒光光譜結果

將0.1 mL Fe3O4@PEI@RN溶液稀釋至2 mL, 測定溶液的發射光譜結果見圖1。由圖1A可以看出, Fe3O4@PEI@RN 納米粒很好地顯示出了ABN 的熒光特性。圖1B顯示出了羅丹明B的熒光特征峰，羅丹明B本身的最大激發波長為560 nm, 最大發射波長為590 nm。由于該熒光團的strokes位移小，散射峰干擾了測定，因此選λex=530 nm為激發波長，此時能較好的顯示出羅丹明B的熒光峰。

圖1A中1, 2分別為樣品在λem=535 nm, λex=443 nm時的激發和發射光譜;

圖1B中1,2分別為樣品在λem=600 nm, λex=530 nm時的激發和發射光譜

圖1Fe3O4@PEI@RN的熒光光譜

2.4　pH值對熒光性能的影響

通過紫外與熒光分析知道, Fe3O4@PEI@RN含羅丹明B 和ABN 兩種熒光發色團。當激發波長為443 nm 時, Fe3O4@PEI@RN 發射綠光，發射波長為532 nm。而用530 nm的波長激發時，發射紅光，最大發射波長為574 nm。圖2為不同pH值 下，熒光強度比值F隨pH值的變化曲線。由圖可知，隨著pH值的逐漸增大, F逐漸減小。由pKa=pH值-log(Imax-I)/(I-Imin)式可以計算出Fe3O4@PEI@熒光納米粒的pKa=6.73。

圖3是分別加入一定不同金屬離子(濃度均為5×10-6mol/L)后測定的F值，可以看出，加入金屬離子后測得的F值與未加金屬離子的空白溶液無顯著變化，因此測定的這些金屬離子不會干擾Fe3O4@PEI@RN納米粒的熒光信號。此外，作者還測定了含有不同濃度的蛋白質和DNA的Fe3O4@PEI@RN溶液，并與空白溶液比較，得出當蛋白質濃度小于14 mg/mL, DNA 濃度小于20 mg/mL時，蛋白質與DNA對F值無明顯影響，因而在測定的時候應該注意溶液中的蛋白質與DNA的量是否會對其熒光產生干擾。

圖2 F隨pH值的變化曲線

圖3 金屬離子對熒光性能的影響

3　討　論

磁性熒光納米粒由于其特殊的磁性質、優良的光學性質、低毒性及生物相容性等，作為新型生物材料在多個領域顯示出優越的應用前景。本文成功制備了一種新型的含有ABN與羅丹明B兩種熒光團的磁性熒光納米材料Fe3O4@PEI@RN。通過對其表征，該磁性熒光納米粒在波長為443 nm和530 nm激發下可分別發出綠光和紅光信號。Fe3O4@PEI@RN 在443 nm 和530 nm下的熒光比值F對pH值敏感，在不同pH值條件下，有不同的響應還測定了部分金屬離子對其熒光測定的干擾，在金屬粒子濃度為5×10-6mol/L時不會干擾Fe3O4@PEI@RN 的熒光測定。基于Fe3O4@PEI@RN納米粒子顯示出的良好特性，在后續的研究中，有望成為一種新的載藥材料使用。

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