ZEB2基因沉默對胃癌細胞奧沙利鉑耐藥性的影響

陳勝東，王達飛，許益芬，姚亞云，龔偉達

(1 江蘇大學醫學院，江蘇鎮江212013；2 宜興市腫瘤醫院)

胃癌5年總生存率低于30%，是導致腫瘤相關死亡的第二大腫瘤，亞洲東部是胃癌發病率最高的地區[1]。目前臨床以手術切除為基礎，輔以放化療的綜合治療是胃癌患者的主要治療方案，奧沙利鉑(L-OHP)及其他鉑類抗癌藥是治療胃癌的一線化療用藥，然而在化療過程中對L-OHP產生獲得性耐藥是導致胃癌患者治療失敗，不良預后甚至死亡的重要原因[2]。近年來，臨床采用多藥聯合的化療方案，以減少化療耐藥的產生、提高臨床療效，但其療效并不理想[3]。越來越多的證據表明，腫瘤細胞化療耐藥性的產生多伴隨上皮間質轉化(EMT)，促進EMT表型的信號通路亦參與了腫瘤化療耐藥性的產生，如TGF-β/Smad4、Wnt/β-catenin信號通路等[4]。據報道，轉錄因子E盒結合鋅指蛋白2(ZEB2)能抑制細胞內E-cadherin表達，促進EMT過程[5]。采用siRNA技術沉默ZEB2基因表達，能逆轉EMT過程[6]。盡管ZEB2的功能已被闡明，然而在腫瘤細胞中沉默ZEB2基因表達的研究較少，尤其是胃癌細胞。2015年1月～2016年6月，我們采用siRNA方法沉默ZEB2基因表達，探討其對胃癌細胞L-OHP耐藥性的影響。

1　材料與方法

1.1材料 胃癌SGC-7901細胞株購自中國科學院上海科學院細胞庫，RPMI1640培養基、胎牛血清、雙抗(青霉素、鏈霉素)、脂質體Lipofectamine 3000和TRIzol試劑購自美國Invitrogen生命技術有限公司，L-OHP購自齊魯制藥(海南)有限公司，MTT溶液試劑盒購自上海哈靈生物有限公司，siRNA干擾片段購自上海吉瑪制藥技術有限公司，RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，qRT-PCR引物序列購自上海生工生物工程技術服務有限公司，RIPA裂解液、BCA試劑盒和ECL發光液購自上海碧云天生物技術有限公司，羊抗人ZEB2多克隆抗體(ab138222)購自美國Abcam公司，鼠抗人GAPDH單克隆抗體(sc-420486)購自美國Santa Cruz公司，HRP標記的鼠抗羊和兔抗鼠二抗分別購自南京金斯瑞生物科技有限公司和上海碧云天生物技術有限公司，Annexin V-FITC/PI試劑盒購自美國BD公司。培養箱(MCO-18AC，日本SANYO公司)，全波長酶標儀(Bio-Rad 公司，美國)，紫外分光光度計(ND-2000，美國Thermo Fisher Scientific科技公司)，熒光定量PCR儀(ABI PRISM?7300，美國ABI公司)，凝膠成像儀(Tanon 4200 SF，上海天能科技有限公司)，流式細胞儀(FACSCanto Ⅱ，美國BD公司)。

1.2耐藥乳腺癌細胞株的構建采用間歇刺激法誘導建立胃癌SGC-7901細胞的耐藥細胞株，細胞均生長于RPMI1640培養基(含10%胎牛血清，10×104U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素)中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養。高濃度L-OHP (注) 20 μg/mL作用于對數生長期的SGC-7901細胞，4 h后撤藥，恢復正常RPMI1640培養液進行培養，每周刺激1次，6個月內共刺激12次，建立的耐藥細胞株命名為SGC-7901/L-OHP。

1.3L-OHP對SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細胞的半數抑制濃度(IC50)值測算采用MTT法。取處于對數生長期的SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細胞，分別接種于96孔板中，每孔接種8×103個細胞，24 h后，棄去舊培養液，每孔分別加入100 μL含有不同濃度L-OHP(0、2.5、5.0、10.0、100、200、400 μg/mL)的RPMI1640培養液，設置3個復孔，繼續培養48 h。棄上清，每孔加入100 μL的MTT溶液(0.5 mg/mL)，37 ℃恒溫孵育4 h，棄上清MTT溶液，每孔加入100 μL DMSO溶劑，充分溶解后，全波長酶標儀測定450 nm波長處的吸光度值，計算細胞存活率。SPASS軟件計算IC50值，耐藥指數(RI)=耐藥細胞的IC50/親本細胞的IC50。

1.4沉默ZEB2基因表達后SGC-7901/L-OHP細胞對L-OHP藥物敏感性檢測采用MTT法。脂質體轉染siRNA-ZEB2或siRNA-NC至SGC-7901/L-OHP細胞中12 h后，不同濃度L-OHP(0、2.5、5.0、10.0、100、200、400 μg/mL)分別處理空白對照組、NC組和si-ZEB2組的SGC-7901/L-OHP細胞48 h，MTT法檢測L-OHP對各組SGC-7901/L-OHP細胞的IC50值。

1.5siRNA-ZEB2對ZEB2基因的沉默效率測算采用熒光實時定量PCR(qRT-PCR)和Western blotting法。取4×105個處于對數生長期的SGC-7901/L-OHP細胞，接種于3.5 cm培養皿中，24 h后分為空白對照組、si-ZEB2組和NC組，si-ZEB2組和NC組采用脂質體Lipofectamine3000分別將siRNA-ZEB2(正向引物：5′-GGCAAGGCCUUCAAAUAUATT-3′，反向引物：5′-UAUAUUUGAAGGCCUUGCCTT-3′)、siRNA無關序列(陰性對照組即NC組)轉染至SGC-7901/L-OHP細胞中，空白對照組不轉染siRNA的SGC-7901/L-OHP細胞，操作步驟參照試劑說明書。

1.6ZEB2 mRNA表達檢測采用qRT-PCR法。TRIzol法抽提細胞總RNA，參照RNA提取試劑盒說明書操作。紫外分光光度計檢測總RNA濃度及純度，逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。ZEB2：正向引物：5′-AGGAGCAGGTAATCG-3′，反向引物：5′-TGGGCACTCGTAAGG-3′。熒光定量PCR儀檢測ZEB2 mRNA表達。qRT-PCR擴增體系為10 μL，反應條件：50 ℃，2 min，95 ℃，10 min，95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，進行35個循環。采用2-ΔΔCt方法計算ZEB2的mRNA相對表達量。

1.7ZEB2 蛋白表達檢測采用Western blotting法。收集細胞，RIPA裂解液抽提細胞全蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。8% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白后，濕轉法將蛋白轉到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉1 h，TBS-T洗膜，分別加入羊抗人ZEB2多克隆抗體和鼠抗人GAPDH單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。TBS-T洗膜后，分別加入HRP標記的鼠抗羊和兔抗鼠二抗,室溫孵育1 h，加ECL發光液進行化學發光顯影，凝膠成像儀觀察蛋白條帶。

1.8細胞凋亡檢測采用流式細胞術(FCM)。脂質體轉染siRNA-ZEB2或siRNA-NC至SGC-7901/L-OHP細胞12 h后，20 μg/mL L-OHP分別處理空白對照組、NC組和si-ZEB2組的SGC-7901/L-OHP細胞48 h，采用FCM，Annexin V-FITC/PI雙染法檢測各組SGC-7901/L-OHP細胞凋亡百分比，收集各組細胞，PBS洗滌2次，加入500 μL Binding Buffer重懸細胞，隨后加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL PI，混勻，室溫避光孵育10 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡百分比。

2　 結果

2.1SGC-7901/L-OHP細胞株的建立 MTT實驗結果顯示，SGC-7901、SGC-7901/L-OHP的IC50值分別為(13.02±3.14)、(100.75±14.16)μg/mL，SGC-7901/L-OHP細胞的RI為7.69，SGC-7901/L-OHP為L-OHP的穩定耐藥細胞株。

2.2SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細胞中ZEB2表達比較 qRT-PCR結果顯示，SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細胞中ZEB2 mRNA相對表達量分別為1.12±0.21、5.62±1.28,ZEB2蛋白相對表達量分別為1.06±0.13、3.38±1.33，耐藥細胞SGC-7901/L-OHP中ZEB2的mRNA和蛋白表達均高于親本SGC-7901細胞(P均<0.05)。

2.3沉默ZEB2基因表達后SGC-7901/L-OHP細胞對L-OHP藥物敏感性的影響MTT實驗結果顯示，si-ZEB2組SGC-7901/L-OHP細胞的IC50值為(27.06±7.43)μg/mL，低于空白對照組的(100.7±14.43)μg/mL和NC組的(91.95±16.43)μg/mL(P均<0.05)，而空白對照組和NC組間差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

實施sbar交班模式后,晨交班時間為(18.25±2.68)min,相比于實施前晨交班時間(26.47±2.97)min,平均縮短8min,實施前后晨交班時間對比差異存在統計學意義,t=10.8729,P<0.05。

圖1　　　　沉默ZEB2基因表達后SGC-7901/L-OHP細胞對L-OHP藥物敏感性

2.4siRNA-ZEB2對ZEB2基因的沉默效率脂質體轉染siRNA-ZEB2或siRNA-NC至SGC-7901/L-OHP細胞中12 h后，qRT-PCR結果顯示，ZEB2的mRNA表達降低至空白對照組和NC組的0.41倍(P<0.05)，而空白對照組和NC組間無統計學差異(P>0.05)；Western blotting實驗結果顯示，ZEB2蛋白表達降低至空白對照組和NC組的0.37倍(P均<0.05)，而空白對照組和NC組間無統計學差異(P>0.05)，表明siRNA-ZEB2干預后SGC-7901/L-OHP細胞中ZEB2基因表達沉默。

2.5各組細胞凋亡率比較FCM實驗結果顯示，si-ZEB2組、空白對照組、NC組SGC-7901/L-OHP細胞凋亡率分別為55.32%±9.63%、20.63%±3.28%、22.83%±4.81%，si-ZEB2組與空白對照組、NC組比較，P均<0.05；而空白對照組和NC組比較，P>0.05。

3　 討論

早期胃癌患者的治療以手術切除為主、化療為輔，然而多數患者就診時已處于晚期，只能化療為主，以提高患者生活質量、延長生存時間。鉑類抗癌藥是胃癌化療的一線用藥，L-OHP是繼順鉑和卡鉑之后的第三代鉑類抗癌藥，具有抗癌譜廣、溶解性及穩定性好等特點，因其療效確切，已逐漸成為治療晚期胃癌的主要藥物，但在化療過程中獲得性耐藥的產生，是導致化療失敗的原因之一。

本研究以SGC-7901為親本細胞，采用體外間歇刺激法，成功建立人胃癌L-OHP耐藥細胞株SGC-7901/L-OHP，并采用MTT法檢測親本細胞SGC-7901及耐藥細胞SGC-7901/L-OHP對L-OHP的敏感性和IC50值，結果顯示，SGC-7901/L-OHP細胞對L-OHP的RI為7.69，建立的SGC-7901/L-OHP細胞株對L-OHP屬于中度耐藥[7]，可用于進一步實驗研究。

EMT是誘發腫瘤細胞發生浸潤轉移的早期關鍵事件，近年來，大量研究發現，腫瘤細胞EMT的發生與耐藥性的產生密切相關。Shen等[8]報道，在子宮頸癌細胞中過量表達microRNA-375促進EMT發生的同時，不僅降低了細胞的增殖能力，且降低了癌細胞對紫杉醇的敏感性；在非小細胞肺癌A549細胞中，沉默MCL-1基因表達，能逆轉EMT介導的化療耐藥[9]。最新證據表明，在卵巢癌[10]的耐藥細胞中，存在ZEB2過量表達。本研究結果顯示，SGC-7901/L-OHP細胞中ZEB2的mRNA和蛋白表達高于SGC-7901細胞，差異有統計學意義，提示ZEB2參與了SGC-7901獲得性耐藥的產生過程。

Fang等[11]在非小細胞肺癌的多藥耐藥細胞H69AR中敲除ZEB2表達后，部分逆轉了細胞的多藥耐藥表型。ZEB2作為抑制E-cadherin表達的轉錄因子，是EMT過程的主要激活因素，在腫瘤細胞化療耐藥中占重要地位。然而，胃癌中并沒有以沉默ZEB2基因表達為基礎的治療方案。SiRNA是一類在腫瘤治療中有巨大應用前景的治療方案，可通過siRNA沉默腫瘤相關蛋白的表達，進而抑制腫瘤的惡性進展[12]。

本研究中，MTT試驗結果顯示，L-OHP對si-ZEB2組SGC-7901/L-OHP細胞的IC50值低于空白對照組和NC組，差異有統計學意義；相同濃度L-OHP處理空白對照組、NC組和si-ZEB2組SGC-7901/L-OHP細胞后。FCM試驗結果顯示，si-ZEB2組SGC-7901/L-OHP細胞凋亡百分比高于空白對照組和NC組，差異有統計學意義，以上試驗結果初步證實，沉默ZEB2基因表達，能增強SGC-7901/L-OHP細胞對L-OHP的化療敏感性，增加細胞凋亡比例，與Jin等[13]研究結果一致。

綜上所述，本研究成功建立對L-OHP耐藥的胃癌細胞株SGC-7901/L-OHP，且發現ZEB2在SGC-7901/L-OHP耐藥細胞中的表達增加，采用siRNA干擾技術沉默SGC-7901/L-OHP耐藥細胞中ZEB2基因表達后，減弱了細胞對L-OHP的耐藥性。

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