用稀釋回歸法對微量血漿標本進行凝血功能檢測的效果探討

毛睿哲，邵雪君

（蘇州大學附屬兒童醫院，江蘇 蘇州 215000）

凝血功能檢測是臨床上在進行止血與血栓篩查時常用的檢查方法，包括進行凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）及纖維蛋白原（FIB）檢測等[1]。過去，臨床上常用手工法進行凝血功能檢測。該方法具有檢測過程繁瑣、耗時較長、對操作人員的要求較高等弊端，已無法滿足現代臨床的需求。目前，臨床上主要使用全自動血凝儀進行凝血功能檢測[2]。該儀器對受檢的血漿標本的容量有一定的要求。然而，在兒科臨床上，新生兒及部分患兒（如患有先天性心臟病）血細胞的比容（多在0.530%～0.800%之間）通常明顯高于正常兒童[3]，其血漿的容量則小于正常兒童。而且，在用全自動血凝儀對微量血漿標本進行檢測時，探針的運動精度、零部件的磨損程度等因素均可導致探針無法吸取足量的血漿標本，或僅吸取了血漿下的血細胞，導致探針的針孔被堵塞，進而使儀器發生故障。因此，如何合理地利用微量的血漿標本進行凝血功能檢測成為臨床上研究的重點。有研究人員發現，在血漿標本中加入與全自動血凝儀配套的樣本稀釋液等液相物質，加大血漿標本的容量，可滿足儀器對血漿標本容量的要求。在本次研究中，筆者通過對蘇州大學附屬兒童醫院收治的43例患兒的血漿標本、2倍稀釋度血漿標本和3倍稀釋度血漿標本進行PT、APTT檢測，探討用稀釋回歸法對微量血漿標本進行凝血功能檢測的臨床效果。

1　標本采集與檢測方法

1.1　標本采集

隨機選取某日在蘇州大學附屬兒童醫院門診、心內科、神經內科、新生兒科、血液科及外科等就診的43例患兒作為研究對象，分別采集其2ml的血漿標本。在采集血漿標本后的1 h內進行本次試驗。對于血細胞比容在0.250～0.550之間的患兒，使用以濃度為3.2%的枸櫞酸鈉溶液（109 mmol/L）為抗凝劑的真空抗凝管，按1：9（抗凝劑與血漿的比例）的比例采集其1.8ml的全血，將二者充分混勻后，以4000 r/min的速度進行10min的離心處理，然后得到2ml的血漿標本。對于血細胞比容＜0.250、＞0.550的患兒，依據Macgann推薦公式計算其抗凝劑的使用量。該公式為：抗凝劑用量（ml）=0.00185×全血量（ml）×[100-患者的血細胞比容（%）][4]。在使用上述的公式計算出抗凝劑的使用量后，將相應量的枸櫞酸鈉溶液（109 mmol/L）加入到惰性塑料采血管內。用一次性塑料注射器抽取患兒1.8ml的血漿，將其立即注入到惰性塑料采血管內，蓋緊瓶蓋，使其與抗凝劑充分混勻，然后以4000 r/min的速度進行10min的離心處理，得到血漿標本。

1.2　儀器與試劑

使用法國STAGO STA-R全自動血凝儀及其配套的試劑與定值質控血漿進行本次試驗。PT試劑與APTT試劑的批號分別為250498、250596。使用與全自動血凝儀配套的Owern-Koller稀釋液進行血漿標本稀釋。正常（N值）定值質控血漿和病理（P值）定值質控血漿的批號分別為12351、12352。在此前進行的預試驗中筆者發現，對血漿標本進行4倍的稀釋后，其APTT值常高于180 s，超出了全自動血凝儀的檢測范圍。因此，本次試驗選擇2倍稀釋度血漿標本和3倍稀釋度血漿標本作為研究的對象。已有的研究報道指出，使用STAGO STA-R全自動血凝儀進行FIB檢測能呈現良好的線性相關度[5-6]，故本文也不再對其進行贅述。

1.3　方法

從這43例患兒的血漿標本中分別吸取1ml的血漿，作為原血漿標本。從這43例患兒的血漿標本中分別吸取0.5ml的血漿，將其與0.5ml 的Owern-Koller稀釋液充分混勻，將該混合液作為2倍稀釋度血漿標本。從這43例患兒的血漿標本中分別吸取0.5ml的血漿，將其與1ml的Owern-Koller稀釋液充分混勻，將該混合液作為3倍稀釋度血漿標本。使用STAGO STA-R全自動血凝儀對上述的三種血漿標本進行檢測，分別得出每種血漿標本的PT值、APTT值。原血漿標本的PT值、APTT值若與2倍稀釋度血漿標本、3倍稀釋度血漿標本的PT值、APTT值呈線性相關，則可得到相應的線性回歸方程。將2倍稀釋度血漿標本、3倍稀釋度血漿標本的PT值、APTT值分別代入回歸方程中，然后將得到的結果與原血漿標本的檢測結果進行對比，觀察這三種血漿標本的檢測結果是否存在統計學差異。

1.4　統計學處理

采用SPSS19.0統計軟件對本次研究中原始數據的散點圖進行分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，最終結果采用配對樣本t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1　對原血漿標本、2倍稀釋度血漿標本及3倍稀釋度血漿標本進行PT、APTT檢測的結果

將原血漿標本的PT值作為橫坐標，將2倍稀釋度血漿標本與3倍稀釋度血漿標本的PT值作為縱坐標，繪制散點圖。結果顯示，兩種不同稀釋度的血漿標本其PT值與原血漿標本的PT值呈線性相關性。用SPSS19.0統計軟件對該散點圖進行分析后，得到相應的回歸方程。其中，2倍稀釋度血漿標本的PT值若為x，原血漿標本的PT值若為y，則回歸方程為：y=0.835x-1.567（r=0.884，P=0.00）；3倍稀釋度血漿標本的PT值若為x，原血漿標本的PT值若為y，則回歸方程為：y=0.353x+5.815（r=0.535，P=0.00）。詳見圖1、圖2。

圖1　原血漿標本與2倍稀釋度血漿標本PT值散點圖的對比

圖2　原血漿標本與3倍稀釋度血漿標本PT值散點圖的對比

將原血漿標本的APTT值作為橫坐標，將2倍稀釋度血漿標本和3倍稀釋度血漿標本的APTT值作為縱坐標，繪制散點圖。結果顯示，兩種不同稀釋度血漿標本的APTT值與原血漿標本的APTT值呈線性相關。其中，2倍稀釋度血漿標本的APPT值若為x，原血漿標本的APPT值若為y，則回歸方程為：y=0.538x+4.215（r=0.785，P=0.00）；3倍稀釋度血漿標本的APTT值若為x，原血漿標本的APTT值若為y，則回歸方程為：y=0.220x+17.816。（r=0.720，P=0.00）。詳見圖3、圖 4。

圖3　原血漿標本與2倍稀釋度血漿標本APPT值散點圖的對比

圖4　原血漿標本與3倍稀釋度血漿標本APTT值散點圖的對比

2.2　對原血漿標本、2倍稀釋度血漿標本及3倍稀釋度血漿標本進行方法學驗證的結果

將2倍稀釋度血漿標本及3倍稀釋度血漿標本的PT值、APTT值分別代入相應的回歸方程中進行換算，并將換算結果與原血漿標本的PT值、APTT值進行配對樣本t檢驗，結果顯示，三種血漿標本的PT值、APTT值相比，P＞0.05。詳見表1、表2。

表1　對原血漿標本與2倍稀釋度血漿標本進行PT、APTT檢測結果的對比 （ ±s ）

表1　對原血漿標本與2倍稀釋度血漿標本進行PT、APTT檢測結果的對比 （ ±s ）

項目　原血漿標本　2倍稀釋度血漿標本　t值　P值PT（s）　14.37±1.41　14.37±1.01　0.978　＞0.05 APTT（s） 41.55±5.58　41.52±4.37　0.958

表2　對原血漿標本與3倍稀釋度血漿標本進行PT、APTT檢測結果的對比 （ ±s ）

表2　對原血漿標本與3倍稀釋度血漿標本進行PT、APTT檢測結果的對比 （ ±s ）

項目　原血漿標本　3倍稀釋度血漿標本　t值　P值PT（s）　14.37±1.41　14.37±0.60　0.975　＞0.05 APTT（s）　41.55±5.58　41.51±3.96　0.950

3　討論

臨床上在進行凝血功能檢測時，對血漿標本與抗凝劑的比例有嚴格的要求。然而，兒童患者及其家屬往往對重復進行血漿標本的采集存在抵觸的心理，大大地增加了兒科采集合格的血漿標本的難度。比如使用容量為1.8ml的真空抗凝管采集1份血細胞比容在0.550左右的血漿標本，在進行離心處理后得到的血漿標本的含量僅在0.81ml左右。血細胞的比容若再增加，則血漿標本的含量將進一步減少。以STAGO STA-R全自動血凝儀為例。該血凝儀的使用說明要求，在用其進行PT、APTT及FIB檢測時，血漿標本的容量須＞0.25ml。而在實際的操作過程中，受儀器探針的運動精度和零部件損耗等因素的影響，所需血漿標本的實際容量必須在0.50ml以上。只有這樣，才能確保該儀器的探針能吸入足量的血漿標本，并對每個項目進行正確的檢測。

在本次研究中，筆者結合前人的研究經驗[7-8]和自身的臨床實踐，對待檢測的血漿標本分別進行了2倍預稀釋和3倍預稀釋，然后采用稀釋回歸法測定預稀釋后血漿標本的PT值和APTT值，以解決由血漿樣本容量較少所帶來的無法進行有效檢測的問題。本次研究的結果表明，2倍稀釋度血漿標本和3倍稀釋度血漿標本的PT值、APTT值與原血漿標本的PT值、APTT值相比，P＞0.05。這說明，用稀釋回歸法對微量血漿標本進行PT、APTT檢測的可行性良好，其檢測結果可滿足一般臨床檢查的需求。各實驗室可依據自身儀器的性能、試劑批號等情況，制定合適的回歸方程來解決類似的問題。

需要注意的是，由于參與本次研究的患兒均不存在彌散性血管內凝血（DIC），也未患有其他的凝血障礙性疾病，故是否可用該檢查方法對血漿標本量偏少、患有DIC或其他凝血障礙性疾病的患兒進行PT、APTT檢測，仍需臨床上進行進一步的研究[9]。

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[3]沈曉明,王衛平.兒科學[M]第7版.北京：人民衛生出版社,2010：92-93,297-298.

[4]從玉隆.臨床實驗室儀器管理[M].北京：人民衛生出版社,2012：140-141.

[5]張敏,呂潔,吳乾波.CS5100全自動凝血分析儀性能驗證[J].實驗與檢驗醫學,2016,34(1)：482-484.

[6]趙威,田笑,陳欣,等.STAGO STA-R全自動血凝儀性能驗證與評價[J].血栓與止血學,2016,22(1)：74-76.

[7]張翠,畢宇,馬曉云.高速離心法和稀釋法處理乳糜血對光學法凝血指標檢測結果的影響[J].國際醫藥衛生導報，2016,22(15)：2342-2343.

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[9]許文榮,王建中,等.臨床血液學實驗[M].第5版.北京：人民衛生出版社,2010：365-370.