采用通用引物PCR技術檢測不同類型人乳頭瘤病毒的研究

郭蕊

【摘 要】人乳頭瘤病毒（human papillomavirus， HPV）在人群中感染率較高，并且宮頸癌等多種腫瘤的發生密切相關，但目前仍缺乏一種簡單快捷的檢測方法。本研究選取中國境內常見高毒力HPV病毒，根據其相對保守序列設計通用引物GP5和GP6，采用PCR法檢測各種HPV。研究結果表明，通用引物GP5和GP6可以檢出HPV-16、18、11、6、52型，但HPV-58、51、31和33型未能檢出。本研究建立的通用引物GP5和GP6已基本涵蓋我國境內高毒力型HPV，具有極高的臨床應用價值。

【關鍵詞】人乳頭瘤病毒；通用引物；PCR

【中圖分類號】R730 【文獻標識碼】A 【文章編號】1672-3783（2018）08-0118-01

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus， HPV）與許多常見病有關，該病毒的研究在人群傳播廣泛。大量研究發現，宮頸癌以及其他腫瘤（包括胃癌、肺癌和食道癌等）均與HPV的感染直接相關[1]。由于HPV種類繁多，目前確認的種類已達到60余種，其中可以感染人的有6型、11型、16型、18型和33型等十余種型別[2]。

核酸雜交技術和聚合酶鏈反應技術（polymerase chain reaction， PCR）是目前檢測HPV的主要方法，但由于HPV型別復雜，現有的PCR-反向點雜交法檢測成本高昂，難以在臨床大規格推廣。我們借鑒國外報道，使用通用引物檢測HPV感染，取得了較好的效果，現將結果報告如下：

1 材料和方法

1.1 標本

6份不同類型HPV標本，采集自本院宮頸糜爛患者宮頸脫落細胞，采用亞能生物技術公司HPV分型檢測試劑盒檢測并確定HPV型別。選取攜帶HPV-11、16、18、31、33、51、52和58型樣本用于本研究。

1.2 試劑和儀器

HPV分型檢測試劑盒購自亞能生物技術（深圳）有限公司；分子雜交儀（YH-H16）購自深圳亞能生物技術有限公司；2×PCR Master Mix預混液購自南京諾唯贊公司；DNA Marker 2000 bp購自上海捷瑞公司；PCR擴增儀和凝膠電泳成像分析系統均購自美國Bio-Rad公司；水平電泳套件購自上海天能生物公司。

1.3 通用引物合成

根據HPV基因組高度保守L1序列設計通用引物，其序列為：HPV-GP5： TTTGTTACTGTGGTAGATAC和HPV-GP6： GAAAAATAAACTGTAAA TCA。其PCR產物預測長度約150 bp。引物由蘇州泓訊生物技術有限公司合成。

1.4 PCR檢測

PCR反應體系為25 μL，包括宮頸脫落細胞DNA模板4 μL，PCR反應上下游引物為1 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，共40個循環，最后72℃延伸10 min。5μL PCR產物于2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

2 結果

2.1 PCR產物檢測結果

采用通用引物進行不同類型HPV檢測后，其產物長度約150 bp。產物條帶清晰易辨，無非特異性擴增，陰性對照無擴增產物（見圖1）。

2.2 通用引物檢測效果

6種HPV標本中，GP5/GP6通用引物可以檢出HPV-16、18、11、6、52型，HPV-58、51、31和33型未能檢出（見圖1）。

3 討論

HPV感染與宮頸癌等腫瘤關系密切，但目前缺乏HPV病毒的體外培養系統，HPV-DNA檢測代替病原學診斷方法，成為HPV感染診斷的“金標準”。PCR法簡單方便，成本低廉，是檢測HPV感染的理想方法。但由于HPV型別眾多，難以尋找到一段保守序列用于引物的設計，因此開發PCR通用引物是檢測不同型別HPV的唯一方法。

本研究根據我國境內常見HPV型別，包括HPV-11、16、18、31、33、51、52和58型L1基因序列[3]，選取相對保守一段序列設計通用引物GP5和GP6。并且在PCR擴增時，采用較低的退火溫度以降低PCR反應嚴謹性，允許引物和目的基因之間存在一定程度錯配，以提高擴增成功率[4]。我們的檢測結果表明，GP5和GP6通用引物可以檢出HPV-16、18、11、6和52型，已基本涵蓋我國境內高毒力型HPV，具有極高的臨床應用價值[5]。

在后續研究中，如需要進行HPV型別鑒定時，可以將陽性PCR產物進行測序，通過BALST比對后即可知道HPV類型。該方法可以節省大量檢測費用，操作簡單，更適合于在臨床推廣使用。

參考文獻

[1]Juan C，Feoli-Fonseca JC，Luc L.Human papillomavirus study of 691 pathological specimens from Quebec by PCR-direct sequencing approach [J].J Med Virol，2001，63（4）： 284-292.

[2]Takeshima E，Tomimori K，Kawakami H，etal.NF-κB activation by Helicobacter pylori requires Akt-mediated phosphorylation of p65 [J].BMC Microbiol，2009，9（1）： 36-44.

[3]Chansaenroj J，Theamboonlers A，Junyangdikul P，etal.Whole genome analysis of human papillomavirus type 16 multiple infection in cervical cancer patients[J]. Asian Pacific J Cancer Prev，2012，13（2）：599-606.

[4]Hildesheim A，Schiffman M，Bromley C，etal.Human papillomavirus type 16 variants and risk of cervical cancer[J].J Natl Cancer Inst， 2001， 93： 315-318.

[5]Cornet I，Gheit T，Franceschi S，etal.The IARC HPV variant study group：human papillomavirus type 16 genetic variants： phylogeny and classification based on E6 and LCR[J].J Virol，2013，86（12）：6855-6861.