胃漿膜下層與門靜脈胰島移植治療糖尿病大鼠的實驗研究

劉國濤，郭棟，劉全達(dá)，程宇，周丁華

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)火箭軍總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧 錦州 121001；2.中國人民解放軍火箭軍總醫(yī)院，北京 100088）

Ⅰ型糖尿病是由于胰島β細(xì)胞缺失引起的自身免疫性疾病。精密的血糖監(jiān)測和頻繁的外源性胰島素給藥延遲了微血管疾病的進(jìn)展，包括視網(wǎng)膜病變和神經(jīng)病變，但并不能完全阻止這些并發(fā)癥[1]。如何治療和預(yù)防Ⅰ型糖尿病及并發(fā)癥的發(fā)展，已成為迫切需要解決的任務(wù)。胰島移植是治愈Ⅰ型糖尿病最有希望的方法[2]。但是，國內(nèi)外對胰島移植的部位還沒有統(tǒng)一認(rèn)識，選擇較多的移植部位是門靜脈、腎包膜等。因此，本實驗通過比較胃漿膜下層和門靜脈胰島移植來觀察糖尿病大鼠的治療效果，尋找更為理想的移植部位，為臨床應(yīng)用提供實驗和理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗動物8～10周齡SD雌性大鼠40只（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心）。

1.1.2 實驗試劑鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）、膠原酶Ⅺ、Hanks液、Ficoll400、RPMI 1640、臺盼藍(lán)購自美國Sigma公司，雙硫腙（Dithizone，DTZ）（北京國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2　方法

1.2.1STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型取8周齡SD雌性大鼠18只，禁食24 h（不禁水）。在黑暗環(huán)境中，將STZ粉末溶于檸檬酸緩沖液中（pH 4.2～4.6）。采用55 mg/kg STZ腹腔一次給藥，將受體大鼠誘導(dǎo)為1型糖尿病。注射后72 h檢測非空腹血糖，連續(xù)5 d在固定時間（上午8：00～10：00）檢測大鼠非空腹血糖＞16.7 mmol/L，并出現(xiàn)多尿、多飲、多食、體重下降等糖尿病癥狀，表明糖尿病大鼠模型復(fù)制成功。按照隨機(jī)數(shù)字表法，將糖尿病大鼠分為胃漿膜組、門靜脈組、對照組，每組6只。

1.2.2胰島分離與純化10%水合氯醛通過腹腔注射麻醉大鼠，取仰臥位固定。切開腹部，暴露膽總管。用動脈夾夾住膽總管上部，以及膽總管與十二指腸交匯處。穿刺膽總管，灌注1 mg/ml膠原酶Ⅺ溶液3～4 ml。胰腺充盈良好后（見圖1），將胰腺組織完整切除，去除胰腺周圍的脂肪和淋巴組織。將胰腺組織剪碎至約1 mm大小后移入離心管中，置于38℃水浴缸中消化20 min，輕微振蕩1 min，見胰腺組織呈泥沙狀，加入冷RPMI 1640液體20 ml終止消化。60目不銹鋼絲網(wǎng)過濾后，將細(xì)胞懸液于4℃、1 000 r/min離心5 min（標(biāo)準(zhǔn)加速度=9，減速度=9），棄上清，洗滌3次后均分到15 ml離心管中，4℃、1 500 r/min離心2 min。向離心管中加入25% Ficoll 4 ml與沉淀物混勻，依次添加23%、20%和11% Ficoll各2 ml，4℃、2 000 r/min離心15 min（標(biāo)準(zhǔn)加速度=5，減速度=2）。離心后將20%～23%和23%～25%界面的胰島吸出，RPMI 1640液洗滌2次，將分離出的胰島移入RPMI 1640培養(yǎng)基，備用。

圖1　 胰腺膠原酶Ⅺ灌注

1.2.3胰島當(dāng)量（islet equivalent，IEQ）和純度測定對胰島進(jìn)行特異性染色，顯微鏡下DTZ陽性細(xì)胞染成猩紅色，其他胰腺組織不著色。胰島細(xì)胞直徑＞150μm為1 IEQ[3]。胰島純度（%）=（DTZ陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%[4]。

1.2.4胰島活性測定0.4%臺盼藍(lán)染色判斷胰島細(xì)胞活性，正常活胰島不著色；死細(xì)胞或細(xì)胞膜不完整的胰島可被臺盼藍(lán)染成藍(lán)色。胰島細(xì)胞成活率（%）=（1-死細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×100%[4]。

1.2.5胰島移植10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉糖尿病大鼠，取仰臥位固定。上腹部正中切口，暴露大鼠胃遠(yuǎn)端，用無損傷組織鑷固定胃遠(yuǎn)端，待胃節(jié)律性收縮后，將裝有1 ml胰島的注射器針頭，穿刺進(jìn)入胃漿膜下層，將備用的500 IEQ注入胃漿膜下層。穿刺完畢后，拔出針頭，用干凈無菌棉簽按壓穿刺部位2 min，直到穿刺部位無液體滲出后，逐層關(guān)閉腹腔。術(shù)后肌內(nèi)注射20萬u青霉素鈉，預(yù)防感染。同時按上述方法將同等數(shù)量的胰島注入門靜脈。對照組則將相同體積的RPMI 1640注射到胃漿膜下層和門靜脈。

1.2.6血糖監(jiān)測STZ模型復(fù)制成功后連續(xù)5 d非空腹監(jiān)測糖尿病大鼠血糖濃度，求其平均值。移植后1周內(nèi)每天在固定時間（上午8：00～9：00）監(jiān)測血糖。以后監(jiān)測血糖3次/周。非空腹血糖持續(xù)≤11.1 mmol/L為移植胰島功能正常的標(biāo)準(zhǔn)，非空腹血糖連續(xù)2 d＞11.1 mmol/L為移植胰島功能喪失的標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.2.7腹腔葡萄糖耐量實驗移植后10 d，禁食12～18 h后測量大鼠血糖濃度。每只動物腹腔內(nèi)注射葡萄糖2 g/kg，并在第0、5、10、15、30、60、90和120 min測量血糖濃度。

1.3　統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗或方差分析，方差分析的兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　胰島分離、純化及活性判斷

分離、純化后的胰島呈圓形或橢圓形細(xì)胞團(tuán)（見圖2A）；DTZ染色后顯微鏡下觀察胰島呈猩紅色，內(nèi)含大量粗糙顆粒（見圖2B）；選取直徑≥150μm胰島，每只大鼠可以獲取（310±42）IEQ，純度達(dá)（89.00±4.52）%。胰島經(jīng)臺盼藍(lán)染色后，可見胰島周邊被染成藍(lán)色（見圖2C），胰島存活率為（89.08±3.76）%。

2.2　胰島移植前后血糖變化

胰島移植后胃漿膜組和門靜脈組大鼠血糖在48 h內(nèi)降至正常，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.081和11.837，P=0.002和0.000）。移植前后，3組大鼠平均血糖濃度比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，門靜脈組胰島移植后的平均血糖濃度低于對照組（P＜0.05）；胃漿膜組胰島移植后的平均血糖濃度低于門靜脈組（P＜0.05）。胃漿膜組和門靜脈組大鼠胰島移植前后血糖濃度比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.406和7.086，均P=0.000），兩組移植后血糖濃度低于移植前。見表1。

對照組、胃漿膜組、門靜脈組在胰島移植后1、3、5、7、11、14、18、21、25 和 28 d 的非空腹血糖濃度比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的血糖濃度有差異（F=162.803，P=0.000）；②3組大鼠血糖濃度有差異（F=2546.796，P=0.000），胃漿膜組和門靜脈組的血糖濃度較對照組低，胃漿膜組和門靜脈組胰島移植后大鼠血糖控制較好；③3組大鼠血糖濃度變化趨勢有差異（F=1591.211，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，胃漿膜組和門靜脈組大鼠18 d時血糖濃度與21、25和28 d比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；21和25 d血糖濃度與28 d比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。見表2和圖3。

圖2　胰島分離、純化及活性判斷　（×10）

2.3　胰島移植后有效控制血糖時間比較

胰島移植后胃漿膜組與門靜脈組有效控制血糖時間分別為（18.0±1.9）和（11.6±2.5）d，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.571，P=0.002），胃漿膜組比門靜脈組控制血糖時間更長。見圖4。

2.4　糖耐受功能比較

胰島移植后10 d，對照組、胃漿膜組、門靜脈組大鼠在空腹?fàn)顟B(tài)下行腹腔葡萄糖耐量實驗。分別于腹腔注射2 g/kg葡萄糖后0、5、10、15、30、60、90和120 min監(jiān)測血糖變化，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點血糖濃度有差異（F=285.789，P=0.000）；②3組大鼠血糖濃度有差異（F=2131.676，P=0.000），門靜脈組和胃漿膜組的血糖濃度較對照組低，門靜脈組和胃漿膜組糖耐受功能較好；③3組大鼠血糖濃度變化趨勢有差異（F=835.737，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，30 min時，3組大鼠血糖濃度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），胃漿膜組糖耐受功能較對照組好，門靜脈組糖耐受功能較胃漿膜組好。見表3和圖5。

表1　3組大鼠移植前后血糖濃度比較（n =6，mmol/L，±s）

表1　3組大鼠移植前后血糖濃度比較（n =6，mmol/L，±s）

注：1）與移植前比較，P ＜0.05；2）與對照組比較，P =0.05；3）與胃漿膜組比較，P ＜0.05

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表2　3組大鼠移植后不同時間點的血糖濃度比較　（n =6，mmol/L，±s）

表2　3組大鼠移植后不同時間點的血糖濃度比較　（n =6，mmol/L，±s）

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圖3　3組大鼠胰島移植后的血糖變化趨勢

圖4　胃漿膜組與門靜脈組大鼠胰島移植后有效控制血糖時間比較　（n =6，±s）

表3　3組大鼠葡萄糖耐量實驗不同時間點的血糖濃度比較　（n =6，mmol/L，±s）

表3　3組大鼠葡萄糖耐量實驗不同時間點的血糖濃度比較　（n =6，mmol/L，±s）

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圖5　3組大鼠胰島移植后腹腔葡萄糖耐量實驗的血糖變化趨勢

3　討論

胰島移植是目前治愈Ⅰ型糖尿病的重要方法之一。胰島移植的成功受多種因素的影響，不僅與胰島高活性及高純度有關(guān)，合適移植部位也成為其能否移植成功的重要因素之一。劉定志等[4]認(rèn)為，理想的移植部位要求移植手術(shù)操作方便、成功率高、并發(fā)癥少、存活率高、易于活檢等[4]。目前，胰島移植的部位主要包括門靜脈、腎包膜、脾、腹膜、大網(wǎng)膜、肌肉等[6]。通過門靜脈移植到肝臟已成為目前最常用的移植部位，但研究發(fā)現(xiàn)其并不是最理想的移植部位[7]。門靜脈內(nèi)氧分壓低、血糖濃度及免疫排斥藥物濃度高、移植胰島接觸血液后易引發(fā)急性血液介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及移植后的胰島栓塞，阻滯門靜脈血流，發(fā)生缺氧和周圍肝組織破壞，這些都是影響胰島存活的重要因素，是移植前期胰島喪失的主要原因[8-9]。胃腸道被認(rèn)為是胰島移植的良好部位，不僅可以提供密集的血管網(wǎng)絡(luò)、血液經(jīng)門靜脈回流入肝，而且與胰腺具有相同的胚胎源性，便于移植[10-12]。胃漿膜下層也可以有效地避免門靜脈胰島移植風(fēng)險。本實驗發(fā)現(xiàn)，胰島移植后胃漿膜組和門靜脈組大鼠血糖濃度較移植前下降，均在48 h內(nèi)降至正常，且低于對照組。胃漿膜組和門靜脈組在移植后21和14 d血糖濃度開始升高，表明胰島功能開始減退；門靜脈組胰島移植后14 d血糖開始升高，表明胃漿膜下層胰島移植血糖的有效控制時間比門靜脈移植時間更長，胃漿膜下層胰島移植的效果要優(yōu)于門靜脈移植。腹腔葡萄糖耐量實驗表明，胰島移植后胃漿膜組和門靜脈組大鼠早期的糖耐受功能良好，與對照組差異明顯。

總之，本實驗結(jié)果表明，胃漿膜下層胰島移植比門靜脈操作更簡單，安全性更高。且本實驗發(fā)現(xiàn)，胃漿膜下層胰島移植的短期治療效果更好。胃漿膜下層有望成為胰島移植的最理想的部位之一。本實驗也為胃漿膜下層胰島移植在臨床的應(yīng)用提供了實驗基礎(chǔ)。但本實驗只涉及2個部位且樣本量較少，還需進(jìn)一步研究證實。

參 考 文 獻(xiàn)：

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