黃芩苷對LPS誘導流產小鼠母胎界面免疫微環境的影響

馬雁南 ，楊小頎

（1.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046； 2.寶雞市第二中醫醫院婦產科，陜西 寶雞 721300；3.陜西中醫藥大學第二附屬醫院生殖科，陜西 咸陽 712046）

妊娠是一個獨特的生理現象，胎兒與母體間的免疫調節既矛盾又復雜[1]。胚胎中帶有一半的父系抗原，作為一種半異己抗原，勢必會激發母體的免疫應答，而遭到母體的排斥。但令人驚嘆的是，正常妊娠并未出現排斥現象，恰恰相反，母胎間“和平相處”，這就是母胎免疫耐受。這一現象的形成機制格外復雜，包含多種免疫反應，免疫遺傳以及子宮局部的免疫調節等。近年來隨著生殖免疫研究的精準化深入，發現妊娠免疫耐受的形成與母胎界面局部的細胞因子保護內環境的穩態密切相關，其中，最為經典的是Th1/Th2細胞因子的平衡模式。Th1型細胞和Th2型細胞是由Th0分化而來的。Th1型細胞分泌的細胞因子包含IFN-γ、TNF-α、IL-2，可對胚胎造成免疫損傷。Th2型細胞分泌的細胞因子包含IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等，對胚胎起免疫保護作用。正常妊娠時母胎界面是以Th2型反應占優勢的[2-6]。

黃芩初載于《本經》，其性涼味苦，具有清熱安胎的作用[7]。中藥安胎歷史悠久，黃芩在諸多安胎方劑中出現，沿用至今，其安胎效果已被臨床實踐所證實[8]，但對其作用機制尚不明了。本實驗選用LPS誘導流產小鼠模型，旨在研究黃芩是如何通過調節子宮局部母-胎界面免疫狀態來發揮安胎作用，從免疫學角度探討黃芩的安胎機理，為中醫學中黃芩“清熱安胎”理論提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及藥品 細菌脂多糖（Lipopolysaccharide from E coli.O111B4），Sigma公司產品；黃芩苷（Baicalin），購于博奧生物醫藥科技有限公司；小鼠INF-γ、IL-4ELISA測試盒，BioSource產品；蛋白酶抑制劑（Aprotinin），Biosharp產品。1.2 試驗動物 6～8周齡SFP級昆明雌鼠，體質量20～22 g（購于第四軍醫大學實驗動物中心），飼養適應環境1周后，陰道涂片法挑選出處于動情期雌鼠，與雄鼠2:1合籠交配，次晨檢出陰栓者，記為孕0 d。1.3 動物分組及處理 受孕小鼠隨機分為正常對照組（A組）、LPS模型（B組）和黃芩苷治療組（C組）。B、C組孕鼠分別于孕7 d給予尾靜脈注射LPS 0.1 μg（0.2 mL）制作流產模型，A組孕7 d尾靜脈注射PBS 0.2 mL。B組自孕4 d開始連續灌胃（磷酸鹽緩沖液0.4 mL/d），共4 d；C組自孕4 d開始連續灌胃（黃芩苷液0.4 mL/（mg.d），共4 d。孕9 d處死所有孕鼠。

1.4 胚胎吸收率和流產率計算 孕9 d頸椎脫臼法處死孕鼠。打開腹腔，暴露子宮，觀察子宮生長情況，記錄胚胎著床數目和胚胎吸收數目。發育正常的子宮胚胎形狀似串珠，色澤光鮮，大小均一，胚胎的中間部位可見紅色條索狀胎盤。而發育異常子宮呈黑紫或褐色，內可見陳舊性出血或伴血凝塊，體積明顯變小，部分胚胎萎縮或消失。解剖鏡下觀察，模糊一片無正常胚胎結構。胚胎吸收率及流產率的計算公式：胚胎吸收率=吸收胚胎數/（吸收胚胎數＋存活胚胎數）×100% 。流產率=流產母鼠數/試驗組母鼠總數×100%

1.5 試驗取樣 在冰盒上完整取出子宮，除去系膜及脂肪組織后稱重。縱向剖開子宮，完整剝離胚胎后稱量子宮凈重。剪下右側子宮，稱重后加入pH＝7.4磷酸鹽緩沖液（內含6倍量0.75 μg/mg蛋白酶抑制劑），立即在低溫環境中進行勻漿，4 ℃，12 000 r/min離心15 min。取上清液分裝，- 80 ℃凍存，用于ELSIA測定IFN-γ、IL-4的含量。

1.7 統計學方法 所有數據使用Excel 2000和SPSS 13.0軟件包進行統計，單變量方差分析組間差異顯著性。試驗數據以均數±標準差（）表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組流產率比較 A組的流產率為20%，正常胚胎居多，胚胎組織新鮮，少見出血、壞死，胚胎吸收率為3.4%。B組中10只孕鼠均發生流產，子宮內無存活胚胎，部分胚胎已經溶化，流產率及胚胎吸收率均為100%，與空白對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。C組的流產率為20%，胚胎吸收率為3.3%，近似A組，2組差異無統計學意義（P＞0.05），但與B組相比差異有統計學意義（P＜ 0.001）。說明LPS可致孕鼠發生流產，而黃芩苷能夠對抗LPS致小鼠流產的作用，具有安胎功效。

2.2 對子宮重量的影響 3組之間比較，B組的小鼠除胚子宮的重量最小（0.043±0.021 5）g，與A、C組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。A組（0.110±0.017 8）g、C組（0.115±0.012 2）g，2組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 3組子宮組織中IFN-γ含量的變化 B組與A、C組相比，差異極顯著，小鼠的子宮組織中IFN-γ含量明顯升高（P＜0.01）。C組小鼠的子宮組織中IFN-γ的含量無明顯升高，與A組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 對IL-4含量變化的影響 B組小鼠子宮組織中IL-4含量最低，與A、C組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；C組小鼠的子宮組織中IL-4含量最高，見表1。

表1 3組子宮組織勻漿中IFN-γ、IL-4的含量比較（，n = 10） pg/mL

表1 3組子宮組織勻漿中IFN-γ、IL-4的含量比較（，n = 10） pg/mL

注：與空白對照組比較，# P＜0.05，## P＜0.01

組 別 IFN-γ IL-4空白對照組 20.413±0.140 24.650±0.213細菌脂多糖組 65.647±0.380 ## 9.413±0.334#黃芩苷組 16.409±0.081 ## 38.179±0.134#

3 討論

隨著科技的突飛猛進，生殖免疫學家對于妊娠免疫耐受這一特殊的生理現象已轉向精準研究。母胎界面微環境的穩定是否與細胞因子的免疫調節相關，已成為這一研究領域的熱點。TAU GZ等[9]研究發現，正常妊娠孕婦體內的IFN-γ的含量顯著降低，而IL-4的含量則明顯增高。IFN-γ能增加Th1型細胞因子的活性，并可阻遏Th2型細胞的分泌，降低IL-4、IL-10的活性。與此同時，IFN-γ還阻止胎盤的發育及滋養細胞的增殖。而IL-4則是維系妊娠免疫耐受的關鍵因子，影響Th0細胞分化成為Th2細胞。研究[10]表明，如小鼠體內缺乏IL-4，則無Th2型反應，其流產率及胚胎吸收率也驟然上升。

細菌脂多糖誘導的流產小鼠是經典的流產動物實驗模型，其致流產機制主要是影響孕鼠的免疫功能，通過活化Th1型細胞，釋放大量的IFN-γ，刺激巨噬細胞分泌過量的TNF-α，放大子宮局部的細胞免疫效應，使母胎微環境中的Th1型細胞因子的整體水平上調，破壞Th1/Th2的平衡，使其偏向Th1型，致使流產發生[11]。

流產又稱為“滑胎”“胎動不安”，中醫認為，其病因多與母胎腎氣不固、沖任虧損所致。腎藏精主生殖，為先天之本。腎氣虛弱易導致滑胎或胎動不安。祖國醫學認為，血熱妄行、熱壅氣滯、血瘀阻滯可影響脾腎功能，進而導致胎動不安、滑胎。故需清熱涼血，健脾補腎[12]。金元朱震亨曰“俗以黃芩為寒性而不敢用，蓋不知胎孕宜清熱涼血，血不妄行，乃能養胎”，并稱其為“安胎圣藥”。黃芩中的有效成分為黃酮類，包括黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷等[13]。大量生殖免疫研究發現，黃芩及其有效成分能夠調節機體的免疫功能，尤其對妊娠期母-胎微環境的發揮著調節作用。張曉思[14]使用黃芩苷提前干預妊娠小鼠，觀察著床期小鼠子宮微環境的變化，發現黃芩苷能夠提升體內IL-10含量，降低IFN-γ含量，使小鼠子宮局部呈現Th2型反應。賴楠楠[15]研究發現黃芩苷能有效降低 URSA小鼠胚胎吸收率，調節母胎界面DC的功能變化，誘導母胎免疫耐受，治療URSA。

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本試驗中，給予黃芩苷提前干預治療的LPS流產模型小鼠，其胚胎存活率高，并且胚胎組織新鮮，發育正常，色澤光滑紅潤，無瘀血、出血現象。流產率及吸收率明顯低于LPS組（P＜0.01），子宮重量明顯高于LPS組。子宮局部的IFN-γ含量最低，而IL-4含量最高，與LPS組比較，P＜0.01。試驗數據顯示，LPS致流產的機制可能是通過升高子宮局部的IFN-γ含量，降低IL-4的含量，使Th1/Th2比例偏向Th1反應，這與之前的研究報道相符合。而黃芩苷的作用恰好相反，其對抗LPS誘導的流產，阻礙IFN-γ的分泌，刺激IL-4的分泌，調節子宮局部免疫功能向著Th2占優勢的平衡模式轉變，具有良好的安胎效果。

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