葡萄籽原花青素對自發性高血壓大鼠左室重塑和氧化應激的影響

張先杰　王曉玲　黃霜枝　靳俊峰　吳秀香

(遵義醫學院珠海校區病理學與病理生理學教研室，廣東　珠海　519090)

1遵義市綏陽縣人民醫院心內科

目前臨床使用的降壓藥物作用單一，且均有一定的副作用，因此，尋找副作用少、能作用于高血壓發病的多個環節，并能改善甚至逆轉臟器損傷，特別是左室重塑的理想藥物頗為重要。研究發現，壓力負荷和氧化應激與高血壓左室重塑發生關系密切〔1〕，而前期研究表明，葡萄籽原花青素(GSP)具有抗氧化、降壓等作用〔2,3〕，因此推測GSP對左室重塑應具有一定的抑制作用。本實驗以自發性高血壓引起的左室重塑為模型，觀察GSP對高血壓左室重塑的抑制作用并從氧化應激方面探討其機制。

1　材料與方法

1.1材料SPF級雄性8 周齡自發性高血壓大鼠(SHR)24 只，同周齡WKY大鼠6 只，體質量(200 ± 20)g，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。GSP(天津尖峰天然產物研究開發有限公司惠贈，純度≥95%)；卡托普利(中美上海施貴寶制藥有限公司)；p47phox(Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔Ⅱ抗(Abcam公司)；血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及羥自由基(OH·)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2方法

1.2.1動物分組與給藥24 只SHR隨機分為4組：SHR組、GSP低和高劑量組及卡托普利組，每組6 只；6 只WKY大鼠為對照組。治療組大鼠每日灌胃給藥1 次，分別為：GSP 50 mg·kg-1·d-1和200 mg·kg-1·d-1；卡托普利 30 mg·kg-1·d-1；對照組及SHR組給予等量蒸餾水灌胃。每次灌胃量2 ml，連續灌胃8 w。

1.2.2大鼠尾動脈收縮壓(SBP)測定采用Tail-cuff測壓法，用大鼠無創尾動脈壓測定裝置、多通道生理信號采集處理系統(RM6420，成都儀器廠)進行動態檢測，每周測壓1次。

1.2.3全心指數和心室指數測定灌胃治療8 w后，稱量大鼠體重，6%水合氯醛(0.5 ml/kg)麻醉大鼠，開胸且迅速摘取心臟，于預冷的生理鹽水(4℃)中沖洗，濾紙吸干，稱重。于4℃下去除左右心房、右心室和大血管等組織，保留完整的左心室(包括室間隔)，濾紙吸干后稱量其質量，分別計算全心質量指數(HW/BW)和左室質量指數(LVW/BW)。

1.2.4病理學指標觀察在心臟左室中部沿橫軸切取0.5 cm厚的心肌組織，4%多聚甲醛溶液中固定，行HE染色和Masson染色，顯微鏡下觀察心肌細胞形態、大小及心肌間質膠原分布情況并使用Digilab2-s軟件拍照(×400)，每個切片中隨機選取80個左心室心肌細胞橫切面，應用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0測量其橫截面積，取平均值作為該大鼠的心肌細胞橫截面積(CSA)。同樣方法測量并計算心肌間質膠原容積分數(CVF)，CVF=心肌間質膠原面積/所測視野面積。

1.2.5心肌組織中SOD、MDA和抑制OH·能力的測定將凍存大鼠心肌組織制成10%的組織勻漿液，4℃、12 000 r/min離心5 min后取上清液，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.6總蛋白的提取和Western印跡檢測p47phox蛋白表達大鼠左室心肌制成10%組織勻漿液，加入等體積的2×上樣緩沖液，煮沸10 min使蛋白變性，12 000 r/min 4℃離心5 min，取上清液，二喹啉甲酸(BCA)法測定樣品的蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉印至硝酸纖維素膜上，封閉、洗膜后與其特定的稀釋過的一抗4℃孵育過夜，洗膜后加二抗37℃搖床孵育45 min，洗膜，顯色，壓片、曝光、顯影、定影于膠片。膠片拍照后，用Image J軟件進行灰度值分析，以實驗各組吸光蛋白條帶平均值與同一樣品中內參條帶的平均值比值作為蛋白的相對含量。

1.3統計學分析采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2　結　果

2.1GSP對SHR SBP的影響灌胃治療8 w后，與對照組相比，SHR組大鼠尾動脈SBP升高顯著(P<0.01)；與SHR組相比，3個治療組大鼠尾動脈SBP均明顯降低(P<0.01)，見表1。

2.2GSP對SHR HW/BW和LVW/BW的影響經灌胃給藥8 w后，與對照組相比，SHR組大鼠的HW/BW和LVW/BW明顯升高(P<0.01)。與SHR組相比，3個治療組均使上述指標降低，以GSP高劑量組和卡托普利組效果明顯(P<0.01)，且二組相比差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.3GSP對SHR心肌細胞形態和CSA的影響SHR組心肌細胞肥大，胞質腫脹，心肌細胞間質增多，CSA明顯增大，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.01)。3個治療組大鼠的上述情況均有所減輕，以GSP高劑量組和卡托普利組效果顯著(P<0.01)，見圖1和表2。

表1　GSP對SHR尾動脈SBP、HW/BW和LVW/BW的影響

與對照組比較：1)P<0.01；與SHR組比較：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

圖1　各組心肌細胞形態變化(HE，×400)

組別CSA(μm2)CVF(%)對照組45398±1817270±022SHR組69892±17171)469±0291)GSP低劑量組67732±16422)436±0272)GSP高劑量組46084±17463)317±0263)卡托普利組45815±17553)295±0223)

2.4GSP對SHR心肌膠原纖維分布和CVF的影響Masson染色將心肌膠原纖維染成藍色。對照組大鼠心肌肌間隙較窄，心肌細胞之間可見少量膠原纖維。SHR組大鼠心肌肌間隙明顯增寬，肌間隙膠原纖維顯著增多，呈柵欄樣排列。3個治療組的肌間隙膠原積聚均有所減少，排列較規則。其中，以GSP高劑量組效果較為顯著，見圖2和表2。

圖2　各組心肌間質膠原纖維變化(Masson染色，×400)

2.5GSP對SHR心肌組織MDA含量、SOD活性和抑制OH·能力的影響給藥8 w后，SHR組心肌組織MDA含量增高顯著(P<0.01)，而SOD活力和抑制OH·能力顯著降低(P<0.01)；3個治療組心肌組織MDA含量均降低，SOD活力以及抑制OH·能力均升高，以GSP高劑量組和卡托普利組效果顯著(P<0.01)，且二者相比差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3　GSP對SHR心肌組織中MDA含量、SOD活性和抑制OH·能力的影響

2.6GSP對SHR心肌組織p47phox蛋白表達的影響SHR心肌組織p47phox蛋白表達(1.75±0.07)較對照組明顯增多(0.96±0.08，P<0.01)，與SHR組相比，GSP低、高劑量組和夫托普利組心肌組織p47phox蛋白表達均顯著降低(1.52±0.06，1.16±0.07，1.09±0.08)，以GSP高劑量組和卡托普利組降低顯著(P<0.01)，見圖3。

1：對照組；2：SHR組；3：GSP低劑量組；4：GSP高劑量組；5：卡托普利組圖3　各組心肌組織p47phox蛋白表達

3　討　論

長期高血壓會導致左室重塑，變化主要包括左室肥大與心肌間質纖維化，前者主要表現為左室心肌細胞體積變大，重量增加，后者主要表現為間質中膠原纖維積聚增多〔1〕。本研究結果表明SHR左室發生了重塑，模型成功建立，GSP具有緩解SHR左室重塑作用。研究證實，持續的壓力負荷增大即機械因素是導致左室重塑的原因之一〔4,5〕，其機制是通過離子通道和細胞形變轉導等機制啟動細胞內信號轉導通道誘發核內基因的重排和活化，導致心肌蛋白合成增加，使心肌細胞肥大、間質纖維化，即發生左室重塑〔1〕。因此，可通

過降低血管壓力而減輕壓力負荷，從而緩解左室重塑。關于GSP的降壓作用，國內外報道較少，意大利學者報道〔6〕，GSP能使輕度高血壓患者血壓顯著降低，對心血管疾病有保護作用。本實驗結果顯示，GSP能使SHR尾動脈尤以高劑量GSP治療組效果顯著，與我們先前的研究結果一致〔2,3〕，表明GSP可以通過降壓而減輕壓力負荷來緩解高血壓的左室重塑。氧化應激在引起左室重塑的多種病因中發揮重要作用〔7〕。氧化應激是持續的高濃度的自由基(主要包括活性氧等)與抗氧化系統失衡所致。NADPH 氧化酶是細胞內活性氧最主要來源〔8〕，p47phox是此酶的4個亞單位之一，在心肌細胞表達。有學者在壓力負荷誘導的心肌肥大和心力衰竭的豚鼠模型上發現p47phox轉位于心肌細胞膜增多，其依賴性的活性氧產生顯著增加〔9〕。活性氧通過刺激轉化生長因子(TGF)-β1分泌和心肌纖維母細胞增殖及膠原合成，最終導致左室重塑〔10〕。本實驗結果顯示，GSP可通過對抗自由基的生成，增強機體抗氧化能力而發揮降壓及緩解高血壓左室重塑的作用。

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3張妍，郭榮年，孫柳青，等.葡萄籽原花青素對腎血管性高血壓大鼠動態血壓、白細胞介素-18和白細胞介素-10水平的影響〔J〕.中國老年學雜志，2015;35(24)：7018-20.

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9Maejima Y，Kuroda J，Matsushima S，etal.Regulation of myocardial growth and death by NADPH oxidase〔J〕.Mol Cell Cardiol，2011;50(3)：408-16.

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