內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對老年輕度認(rèn)知功能障礙大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

程　琳　張培華　張　韡　

(南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院，河南　南陽　473004)

內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)具有促進(jìn)血管新生的功能〔1,2〕。近年EPCs移植術(shù)在治療血管相關(guān)性疾病一直是研究的熱點(diǎn)〔3〕。老年癡呆是目前全世界都普遍存在的醫(yī)學(xué)難題，目前尚沒有理想的治療手段〔4,5〕。而輕度認(rèn)知功能障礙(MCI)正是介于正常老化和癡呆之間，病患表現(xiàn)出輕度記憶或其他認(rèn)知功能損害但不影響日常生活能力的一種亞臨床狀態(tài)，是一種可干預(yù)的癡呆前狀態(tài)，也是預(yù)防性干預(yù)的最佳階段。本研究探討EPCs移植對MCI大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響。

1　材料與方法

1.1材料140～160 g雄性SD大鼠購自華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；α-MEM、L-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；實(shí)驗(yàn)過程中使用的單抗均購自美國Santa Cruz公司，其他試劑均為市售分析純。

1.2EPCs分離培養(yǎng)采用脫頸椎方法處死大鼠后迅速將大鼠浸泡在75%乙醇中消毒10 min，超凈臺中解剖大鼠，去除大鼠腿部肌肉后分離出股骨和脛骨后使用α-MEM培養(yǎng)液沖洗3次后減去股骺端，使用5 ml注射器吸取標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，兩端各沖洗3次后收集細(xì)胞懸液至于1 000 r/min離心10 min后棄去上清液和脂肪層后制備單細(xì)胞懸液，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中。24 h后棄去非貼壁細(xì)胞，全量更換培養(yǎng)液后每48 h更換1次培養(yǎng)液直至細(xì)胞生長至80%～90%融合度后按照1∶2的比例進(jìn)行傳代，傳至第3代后棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入含有20 ng/ml的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和20 ng/ml的成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)后繼續(xù)培養(yǎng)并隔日更換1次培養(yǎng)液，直至大部分細(xì)胞呈片狀，棒狀細(xì)胞伴有短突起，多數(shù)細(xì)胞呈紡錘形后得到EPCs。

1.3老年MCI大鼠篩選選取30周齡以上大鼠至Y-迷宮中，適應(yīng)3 min后給予電擊(電流強(qiáng)度0.7 mA，電壓50 V，電擊延時(shí)5 s)，選擇對3臂均探索進(jìn)入的大鼠，淘汰反應(yīng)過于遲鈍或特別敏感的大鼠，后將篩選得到的大鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)訓(xùn)練。將得到的大鼠隨機(jī)分為模型組、EPCs組，選取8～10周齡的大鼠作為正常組。

1.4方法將分離培養(yǎng)得到的細(xì)胞經(jīng)消化計(jì)數(shù)后使用磷酸鹽緩沖液(PBS)調(diào)整到4×106個(gè)/ml，將移植組大鼠使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后使用尾靜脈注射0.5 ml EPCs懸液，模型組大鼠采用相同操作，且注射0.5 ml PBS。通過Morris水迷宮法在注射EPCs前、注射后1 d、7 d、14 d和28 d進(jìn)行行為學(xué)測定，包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。各組在完成注射后28 d麻醉。迅速摘取大鼠腦部，并置于液氮中備用。測定腦組織三磷酸腺苷(ATP)酶活力、丙二醛(MDA)、白細(xì)胞介素(IL-6)和超氧化物歧化酶(SOD)含量；并通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒測定腦組織中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、環(huán)鳥苷酸(cGMP)和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS15.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1各組平均潛伏期比較在第0天時(shí)，模型組和移植組平均潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，正常組與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明大鼠處于認(rèn)知障礙狀態(tài)。隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長，各組大鼠平均潛伏期均顯著低于第0天(P<0.05)，而與模型組相比，移植組在第1天、第7天、第14天及第28天數(shù)據(jù)均顯著降低(P<0.05)，見表1。

2.2各組腦組織相關(guān)炎癥因子比較模型組腦組織MDA和TNF-α顯著高于正常組(P<0.05)；移植組與模型組相比，腦組織MDA和TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。與正常組相比，模型組SOD和IL-6水平顯著降低，而EPCs移植后SOD和IL-6水平顯著提高(P<0.05)，見表2。

2.3各組腦組織ATP酶活力、NO、NOS和cGMP含量比較模型組NO、NOS和cGMP含量顯著高于正常組(P<0.05)，與模型組相比，移植組NO、NOS和cGMP含量顯著降低(P<0.05)。模型組腦組織ATP酶活力顯著低于正常組，而移植組腦組織ATP酶活力顯著高于模型組(P<0.05)，見表2。

表1　各組平均潛伏期比較

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05；與本組第0天比較：3)P<0.05，下表同

表2　各組腦組織炎癥因子、ATP酶活力、NO、NOS、cGMP含量比較

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3　討　論

正常的血液循環(huán)是維持機(jī)體組織、細(xì)胞保持正常生理功能的基本條件。而隨著年齡的增加，腦部血流量不足會(huì)導(dǎo)致組織局部缺血，導(dǎo)致局部組織能量代謝障礙、活性氧增多，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)發(fā)生，最后炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡導(dǎo)致組織損傷，進(jìn)而引起認(rèn)知功能障礙〔6,7〕。而增加腦部供血不足區(qū)域的缺血，可以減少細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡，增加腦部修復(fù)能力，但是由于缺乏對已經(jīng)受損的神經(jīng)元修復(fù)和突觸間功能的恢復(fù)，這類治療方法目前仍沒有取得滿意的療效。基于這樣的目的，目前依托于干細(xì)胞技術(shù)的不斷發(fā)展，通過從具有較強(qiáng)分化能力的干細(xì)胞中獲得更好的治療方法是目前研究熱點(diǎn)。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是目前研究最為熱門的干細(xì)胞，由于獲取方便且分化能力強(qiáng)可在體位大量擴(kuò)增〔8〕。通過在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)培養(yǎng)過程中添加神經(jīng)營養(yǎng)因子和血管生長因子可以使得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向EPCs定向分化。本研究提示在移植EPCs后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力顯著提高，腦組織炎癥水平顯著下降。腦部的炎癥會(huì)導(dǎo)致腦部神經(jīng)損傷甚至于學(xué)習(xí)記憶能力相關(guān)的神經(jīng)元凋亡，降低腦部炎癥水平有助于恢復(fù)學(xué)習(xí)記憶能力。NO是哺乳動(dòng)物體內(nèi)普遍存在的一種強(qiáng)生物活性物質(zhì)，由NOS催化生成，NO在體內(nèi)有著廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，其主要是通過下游cGMP產(chǎn)生作用，與相關(guān)研究〔9,10〕本研究顯示，EPCs可能通過提高腦組織ATP酶的活力，從而降低腦組織細(xì)胞中線粒體損傷，減輕大鼠缺血再灌注損傷。

1楊亞榮,曾秋棠,郎明健,等.內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對大鼠心肌梗死后缺血心肌血管再生及心功能的影響〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù),2008;12(25):4815-8.

2孔朝紅,劉煜敏,朱江，等.自體骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞移植改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能轉(zhuǎn)歸〔J〕.國際腦血管病雜志,2012;20(4):257-62.

3姜坤,李傳勇,孟慶友，等.內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療慢性深靜脈血栓形成的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中華普通外科雜志,2010;25(1):61-4.

4毛梅,張波,傅祖紅,等.內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對肺損傷炎癥狀態(tài)的影響〔J〕.中國組織工程研究,2013；17(10):1780-4.

5肖方毅,張懷勤,蔡雪黎,等.自體內(nèi)皮祖細(xì)胞移植修復(fù)兔動(dòng)脈內(nèi)皮損傷〔J〕.中國動(dòng)脈硬化雜志,2007;15(10):738-42.

6王寧,王護(hù)國,姜濤,等.基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α預(yù)處理內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療糖尿病下肢缺血〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù),2011;15(36):6749-52.

7元榮榮,朱麗萍,李丹丹,等.骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變的療效觀察〔J〕.中華內(nèi)分泌代謝雜志,2015;31(11):982-7.

8于萍,李強(qiáng),劉穎,等.內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對糖尿病兔下肢缺血的病理及血管內(nèi)皮生長因子的影響〔J〕.中國實(shí)用內(nèi)科雜志,2007;27(15):1207-9.

9張京臣,謝慧,湯魯明,等.內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對油酸誘發(fā)兔急性肺損傷時(shí)炎性反應(yīng)的影響〔J〕.中華麻醉學(xué)雜志,2014;34(5):627-30.

10徐明國,陶軍,王潔梅,等.內(nèi)皮祖細(xì)胞移植修復(fù)大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮損傷〔J〕.中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2006;27(4):365-8.