干擾Wnt1基因表達對乳腺癌細胞侵襲、遷移能力的影響

李黎洪　徐巧莉　陳智偉　陳　昱　吳麗婷　胡建雄

(莆田學院附屬醫院乳腺外科，福建　莆田　351100)

1莆田學院附屬醫院綜合病房2莆田學院附屬醫院病理科

3莆田學院附屬醫院重癥監護室

據報道，乳腺癌發病率和死亡率逐年上升，發病率約為女性惡性腫瘤的29%〔1〕，年齡的增加、酗酒、吸煙、肥胖等均可導致乳腺癌的發生。目前，乳腺癌的診斷和治療方法取得了一系列的發展，但其五年生存率仍較低〔1～3〕。乳腺癌的發病機制并不完全清楚。研究表明，乳腺癌的發生、發展受多種細胞因子、分子信號通路的影響〔4〕。經典Wnt信號通路調控基因轉錄、細胞增殖、分化等，對癌癥的發生、發展過程起重要作用。Wnt1是一類Wnt基因的總稱，對結構相似的分泌性信號轉導蛋白具有編碼作用。既往研究表明，大部分Wnt基因在乳腺癌組織中的表達量增加，促進下游靶基因的表達，參與乳腺癌的發生、發展〔5〕。本研究通過小RNA特異性調節Wnt1基因表達，研究下調Wnt1基因水平對乳腺癌細胞侵襲、遷移的影響及對Wnt1/β-連環蛋白(β-catenin)信號通路的影響。

1　材料與方法

1.1主要試劑及儀器人乳腺癌細胞系MCF-7購自美國模式菌種收集中心(ATCC)，杜爾伯科極限必需培養基(DMEM)培養基 、胎牛血清購自美國Sigma公司，Matrigel基質膠購自美國BD公司，Transwell小室購自美國Corning公司，Wnt1抗體、β-catenin抗體、細胞周期素(cyclin)-D1購自美國Abcam公司，β-肌動蛋白(actin)抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔二抗購自南京碧云天生物科技有限公司，恒溫培養箱購自日本SANYO公司，臺式高速(低溫)離心機、凝膠成像儀購自美國ThermoFisher Scientific公司。

1.2細胞培養將凍存MCF-7細胞置于37℃水浴鍋中迅速溶化，轉入6孔細胞培養板中，加入含10%胎牛血清、1%雙抗的新鮮培養基，在5%CO2、37℃細胞培養箱中培養過夜。待細胞匯合度達80%～90%，加入胰酶消化細胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，吹打，制成新的細胞懸浮液，離心，棄上清，加入新鮮培養基繼續培養，每2～3 d傳代一次。

1.3細胞轉染轉染前24 h，細胞接種于24孔板中，在37℃恒溫箱中培養，待細胞匯合度達到50%以上，加入Opti-MEM I培養基，分別將Lipofectamine 2000和siRNA-陰性對照(NC)或siRNA-Wnt1稀釋為5 μl/孔、1.25 μl/孔，室溫孵育20 min，將復合物加入24孔板中，混勻，置于5% CO2、37℃培養箱中培養4～6 h，更換為生長培養基，48 h后進行其他實驗。實驗分為對照組，shRNA-NC組，shRNA-Wnt1組，免疫印跡實驗(Western印跡)觀察轉染后細胞中Wnt1蛋白的表達量。

1.4細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力提前在6孔細胞培養板背后均勻劃線；將轉染后的細胞以8×104個/孔接種于6孔板中，在5% CO2、37℃細胞培養箱中培養過夜，使用無菌的10 μl槍頭在細胞表面劃線，盡量垂直于培養板背后的線條，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，加入無血清的新鮮DMEM培養基，置于細胞培養箱中培養48 h，采用Image J軟件分析劃痕面積。

1.5Transwell法檢測細胞侵襲能力實驗前，采用無血清的培養基按1∶8的比例稀釋Matrigel基質膠(50 mg/L)，包被Transwell小室基底膜的上室面，4℃通風6 h,細胞提前饑餓12～24 h，胰酶消化轉染后48 h的細胞，以8×104個細胞接種到Transwell小室上室中，下室中加入600 μl含15%胎牛血清的培養基，避免產生氣泡，將小室放入24孔板中，放入5% CO2、37℃培養箱培養48 h，棉簽輕輕拭去上室中未通過濾膜的細胞，甲醇固定下室細胞10 min，結晶紫染色2 min，在倒置顯微鏡下觀察計數，每組5個復孔，實驗重復3次。

1.6Western印跡檢測細胞中β-catenin、cyclin-D1蛋白的表達水平棄去培養基，預冷的PBS清洗細胞，加入預冷的細胞RIPA裂解液，在冰上放置30 min，細胞刮板收集細胞，12 000 r/min離心半徑7.0 cm，10 min，取上清，BCA法蛋白定量。取30 μg蛋白與4倍上樣緩沖液混合均勻，100℃變性10 min。將提前配置的PAGE膠固定于電泳槽中，加入樣品蛋白，80 V電泳20 min，當溴酚藍遷移至濃縮膠與分離膠界面處，調整電壓至130 V，電泳1 h，待溴酚藍電泳至凝膠底部，切斷電源，將電泳凝膠所攜帶的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，TBST漂洗硝酸纖維素膜，加入10 ml 5%脫脂牛奶封閉，4℃過夜，加入適量稀釋的一抗，37℃結合1～2 h。TBST緩沖液清洗3次，每次10 min，加入適量比例稀釋二抗，37℃結合1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。顯色5 min，曝光30～60 s，顯影2 min，定影1 min，沖洗晾干，以β-actin為對照，凝膠成像儀檢測目的蛋白灰度值。

1.7統計學方法應用SPSS21.0軟件，計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩樣本差異使用LSD-t檢驗。

2　結　果

2.1檢測細胞轉染效果與對照組(Wnt1/β-actin:0.865±0.074)相比，shRNA-NC組細胞中Wnt1蛋白(0.883±0.092)的表達量差異無統計學意義(P>0.05)，但shRNA-Wnt1組細胞中Wnt1蛋白(0.421±0.065)的表達量顯著降低(P<0.05)，表明轉染Wnt1小干擾RNA可使MCF-7細胞表達的Wnt1蛋白減少。見圖1。

圖1　轉染后細胞中Wnt1蛋白的表達量

2.2下調Wnt1基因表達對細胞侵襲能力的影響與對照組相比，shRNA-NC組細胞侵襲數差異無統計學意義(P>0.05)，shRNA-Wnt1組細胞侵襲數顯著降低(P<0.05)，表明下調MCF-7細胞表達的Wnt1可降低細胞的侵襲能力。見表1。

2.3下調Wnt1基因表達對細胞遷移能力的影響與對照組相比，shRNA-NC組細胞的劃痕面積差異無統計學意義(P>0.05)，shRNA-Wnt1組細胞的劃痕面積顯著減少(P<0.05)，表明下調乳腺癌MCF-7細胞中Wnt1基因的表達量可降低細胞的遷移能力。見表1。

表1　下調Wnt1基因表達對細胞侵襲能力和遷移能力的影響

與對照組相比：1)P<0.05，下表同

2.4下調Wnt1基因表達對細胞中β-catenin、cyclin-D1蛋白表達量的影響與對照組相比，siRNA-NC轉染MCF-7細胞系后，β-catenin、cyclin-D1蛋白的表達量沒有明顯變化；siRNA-Wnt1轉染MCF-7細胞后，β-catenin、cyclin-D1蛋白的表達量明顯下調(P<0.05)，表明下調Wnt1基因表達可有效降低乳腺癌細胞中β-catenin、cyclin-D1蛋白水平。見表2，圖2。

圖2　下調Wnt1基因表達對細胞中β-catenin、cyclin-D1蛋白表達量的影響

組別β?catenin/β?actincyclin?D1/β?actin對照組0468±00620787±0075shRNA?NC組0452±00570792±0083shRNA?Wnt1組0215±00231)0326±00681)

3　討　論

乳腺癌常見的治療的方法有藥物治療、手術、放療等，其中手術為主要的治療方法。但因乳腺癌的生長方式具有侵襲和浸潤能力，早期極容易發生轉移，因此不能采用手術全切的方法，目前多以綜合治療手段為主〔6，7〕。乳腺癌具有侵襲、遷移的生物學特性，是其容易產生局部或者遠端轉移并發生惡性浸潤生長的主要原因〔8〕。在乳腺癌的治療中，抑制細胞的侵襲、遷移能力十分重要，對控制乳腺癌的發展和提高5年生存率、改善預后有著重要的意義。本文結果提示Wnt1有望成為新的乳腺癌治療的靶點。

Wnt1是最早被發現的Wnt家族的成員之一，是Wnt/β-catenin信號轉導通路中的重要信號傳遞因子〔9〕。當機體發生病理性異常時，Wnt1被激活，破壞β-catenin結合E鈣黏附蛋白和細胞骨架蛋白等多蛋白復合物，使得細胞質中的非磷酸化β-catenin水平增多，進入細胞核，從而激活Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因(cyclin-D1等)，調控多種腫瘤的發生、發展〔10〕。Wnt/β-catenin信號轉導通路是經典的Wnt信號通路。研究表明Wnt1在乳腺癌組織中的表達量顯著高于正常乳腺組織，與乳腺癌的發生、發展、轉移密切相關〔11〕。抑制Wnt/β-catenin信號轉導通路的活化誘導乳腺上皮細胞惡性增殖，促進腫瘤的發生〔12，13〕。報道證明抑制Wnt1基因的表達可誘導乳腺癌細胞凋亡〔14〕。但目前關于Wnt1信號通路對乳腺癌侵襲、遷移的作用機制的相關報道較少，本研究結果提示下調Wnt1基因水平可能通過抑制Wnt1/β-catenin信號通路介導的下游靶基因的水平，降低乳腺癌細胞的侵襲、遷移能力。

綜上所述，siRNA Wnt1可特異性降低乳腺癌細胞中Wnt1基因的表達量，抑制Wnt1/β-catenin信號通路介導的下游靶基因cyclin-D1的水平，從而下調乳腺癌細胞的侵襲、遷移能力，為乳腺癌的臨床診斷和治療提供新的分子靶點，具有一定的現實意義。

1Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2016〔J〕.CA Cancer J Clin,2016;66(1):7-30.

2De Santis CE,Fedewa SA,Goding-Sauer A,etal.Breast cancer statistics,2015:convergence of incidence rates between black and white women〔J〕.CA Cancer J Clin,2016;66(1):31-42.

3Burandt E,Grünert M,Lebeau A,etal.Cyclin D1 gene amplification is highly homogeneous in breast cancer〔J〕.Breast Cancer,2016;23(1):111-9.

4張博,陳曉芳,黃勛,等.2015 年中國動物遺傳學研究領域若干重要進展〔J〕.遺傳,2016;38(6):467-507.

5郎磊,周明莉,楊佳佳,等.穩定干擾ITGB1抑制人乳腺癌BT549細胞遷移和侵襲〔J〕.基因組學與應用生物學,2017;36(5):1737-42.

6Hu XC,Zhang J,Xu BH,etal.Cisplatin plus gemcitabine versus paclitaxel plus gemcitabine as first-line therapy for metastatic triple-negative breast cancer(CBCSG006):a randomised,open-label,multicentre,phase 3 trial〔J〕.Lancet Oncol,2015;16(4):436-46.

7Zhang J,Wang Z,Hu X,etal.Cisplatin and gemcitabine as the first line therapy in metastatic triple negative breast cancer〔J〕.Int J Cancer,2015;136(1):204-11.

8Vimala K,Shanthi K,Sundarraj S,etal.Synergistic effect of chemo-photothermal for breast cancer therapy using folic acid(FA) modified zinc oxide nanosheet〔J〕.J Coll Interface Sci,2017;488(2):92-108.

9趙軼峰,楊永江,王曉元,等.Wnt 信號通路在姜黃素誘導乳腺癌 MCF-7 細胞凋亡中作用機制〔J〕.實用癌癥雜志,2017;32(2):188-91.

10Li J,Yang S,Su N,etal.Overexpression of long non-coding RNA HOTAIR leads to chemoresistance by activating the Wnt/β-catenin pathway in human ovarian cancer〔J〕.Tumor Biol,2016;37(2):2057-65.

11Akalay I,Tan TZ,Kumar P,etal.Targeting WNT1-inducible signaling pathway protein 2 alters human breast cancer cell susceptibility to specific lysis through regulation of KLF-4 and miR-7 expression〔J〕.Oncogene,2015;34(17):2261.

12Jang GB,Hong IS,Kim RJ,etal.Wnt/β-catenin small-molecule inhibitor CWP232228 preferentially inhibits the growth of breast cancer stem-like cells〔J〕.Cancer Res,2015;75(8):1691-702.

13Yang L,Tang H,Kong Y,etal.LGR5 Promotes breast cancer progression and maintains stem-like cells through activation of wnt/β-catenin signaling〔J〕.Stem Cells,2015;33(10):2913-24.

14Si W,Li Y,Shao H,etal.MiR-34a inhibits breast cancer proliferation and progression by targeting Wnt1 in Wnt/β-catenin signaling pathway〔J〕.Am J Med Sci,2016;352(2):191-9.