補腎祛寒治尪湯對類風濕關節炎模型大鼠血清IL-1、IL-2及TNF-α水平的影響

吳　丹　李潔芳　肖玉坤　胡　燦　伍亞男　李　茜　劉　君

(長沙市第四醫院中醫科，湖南　長沙　410006)

類風濕關節炎(RA)以炎性滑膜炎為主要特征，臨床表現為手、足的多個大關節和小關節出現疼痛、腫脹等現象，同時受累關節在清晨出現僵硬，嚴重者會出現不同程度的關節畸形〔1〕。隨著病情的發展，骨骼會受到持續性破壞，可導致關節功能喪失，最終殘疾。RA在中醫領域被認為是尪痹類疾病，補腎祛寒治尪湯是一種主治尪痹腎虛寒盛證的方劑，常用于治療RA、強直性脊柱炎、結核性關節炎等疾病，具有補腎祛寒、散風祛濕、活血通絡的功效〔2〕。甲氨蝶呤是一種葉酸還原酶抑制劑，對RA有較好的治療效果〔3〕。為進一步探究補腎祛寒治尪湯治療RA的機制，本研究建立了膠原誘導性關節炎大鼠模型，分析補腎祛寒治尪湯對模型大鼠血清白細胞介素(IL)-1、IL-2及腫瘤壞死因子(TNF)-α水平的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物選取健康清潔級SD大鼠75只，鼠齡45～50 d，體重(200±20)g，光照時間為6：00～18：00，環境噪音控制在(40±10)db，溫度控制在(20±3)℃，期間大鼠均自由飲食、飲水，正常飼養1 w，待大鼠適應環境后進行動物實驗。大鼠均由河北醫科大學實驗動物中心提供。

1.2儀器和試劑牛Ⅱ型膠原、醋酸水(北京博蕾德生物科技有限公司)；完全弗氏佐劑(上海偉進生物科技有限公司)；一抗、二抗、酶聯免疫試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)，乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液、二甲苯(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3分組與建模方法75只大鼠按照隨機數字表法分為正常對照組(15只)、模型對照組(20只)、甲氨蝶呤組(20只)和補腎祛寒治尪湯組(20只)。除正常對照組外的大鼠均進行膠原誘導造模〔4〕，方法如下：將牛Ⅱ型膠原(10 mg)與0.1 mol/L醋酸水(5 ml)均勻混合，配制成濃度為2 mg/ml的溶劑，置于4℃的環境下過夜，將5 ml上述溶劑與5 ml完全弗氏佐劑(CFA)均勻混合，置于4℃環境中直至完全乳化，配制成濃度為1 mg/ml的乳化液，給大鼠注射乳化液進行初次免疫，分別從尾根部選取1個點、任選一后足掌選取1個點、背部選取3個點進行皮下注射，0.2 ml/只；在初次免疫后第7天再次進行皮下注射乳化液。正常對照組大鼠在相同的時間皮下注射等劑量的生理鹽水。通過病理組織檢測來判斷建模是否成功。

1.4藥物制備

1.4.1補腎祛寒治尪湯制備參考焦樹德〔5〕編著的《焦樹德臨床經驗輯要》制備補腎祛寒治尪湯，所有藥材經專家鑒定均符合中國藥典2005年版一部的規定。主要成分：松節15 g、炙山甲9 g、地鱉蟲10 g、熟地20 g、制附片9 g、羌活10 g、骨碎補18 g、桂枝10 g、白芍15 g、知母12 g、獨活10 g、威靈仙15 g、川斷15 g、防風10 g、補骨脂15 g、麻黃6 g、伸筋草20 g、赤芍10 g、淫羊藿10 g、蒼術10 g、川牛膝12 g，共含生藥261 g。配好藥方后進行常規煎煮，湯藥濃縮至90 ml，含生藥量為2.9 g/ml，于4℃的環境下保存待用。

1.4.2甲氨蝶呤混懸液制備將甲氨蝶呤片(湖南正清制藥集團股份有限公司，國藥準字H19983205，規格：2.5 mg/片)磨研成粉末，加入無菌蒸餾水混合均勻，配制成濃度為0.2 mg/ml的藥物混懸液。

1.5給藥方法所有大鼠在初次免疫后的15 d進行灌胃給藥。正常對照組及模型對照組給予無菌蒸餾水灌胃，10 ml/kg，1次/d，連續28 d。甲氨蝶呤組給予甲氨蝶呤混懸液灌胃，10 ml/kg，1次/d，連續28 d。補腎祛寒治尪湯組給予補腎祛寒治尪湯灌胃，10 ml/kg，1次/d，連續28 d。

1.6觀察指標

1.6.1大鼠的一般狀態觀察各組大鼠的一般狀態，包括活動量、食欲、體重、毛色、關節腫脹情況等。

1.6.2關節腫脹度在用藥前、用藥14 d后和28 d后采用足容積檢測儀測量大鼠的足容積，并計算其關節腫脹度，關節腫脹度=用藥前后的足容積之差/治療前足容積。

1.6.3染色處理在用藥28 d后，給予10%水合氯醛進行麻醉，將大鼠處死。取下大鼠的后爪(包括踝關節)、雙側膝關節，將其肌纖維和毛皮剪掉，浸泡在10%中性甲醛中固定24 h；標本固定好后，將其置于14%EDTA脫鈣液中脫鈣5 d，脫鈣完成后使用5%硫代硫酸鈉液進行中和處理，水洗12 h，常規梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。蠟塊縱切成5～6 μm的切片，將其放置在60℃烤箱中烘烤30 min，進行HE染色和TRAP 染色，中性樹脂封片，在400倍高倍鏡下觀察。

1.6.4酶聯免疫吸附法(ELISA)測定IL-1、IL-2及TNF-α水平在用藥28 d后，斷頭取血，血液標本在2℃～8℃、3 000 r/min離心15 min，取上清。按照ELISA試劑盒說明進行檢測：將抗體包埋在酶標板孔內，加入100 μl待檢標本，在37℃的環境下孵育1 h，使用洗漆液進行洗漆處理，加入生物素2抗體結合物，在37℃的環境下孵育1 h，進行洗漆處理，加入親和素2酶結合物，在37℃的環境下孵育30 min，進行洗漆處理，加入TMB底物溶液，顯色20 min后終止反應。由試劑盒提供的標準品建立標準曲線，經計算機擬合，自動計算每一樣品中細胞因子的濃度。

2　結　果

2.1各組一般狀態比較正常對照組大鼠一切正常，毛發光亮，精神狀態好，活動量較大，食欲較強，體重無明顯變化，關節無腫脹。模型對照組大鼠毛發稀松且光澤度較差，精神萎靡，食欲不振，活動極少，體型瘦小，關節腫脹明顯。甲氨蝶呤組和補腎祛寒治尪湯組大鼠毛發光澤度一般，精神狀態良好，活動較少，食欲一般，體重較輕，有一定程度的關節腫脹。

2.2各組關節腫脹度比較用藥14 d、28 d后，其他3組關節腫脹度均顯著高于正常對照組，甲氨蝶呤組和補腎祛寒治尪湯組顯著低于模型對照組，差異均有統計學意義(均P<0.05)；用藥28 d后補腎祛寒治尪湯組關節腫脹度顯著低于甲氨蝶呤組(P<0.05)；隨著時間的推移，模型對照組的關節腫脹度顯著增加，甲氨蝶呤組和補腎祛寒治尪湯組的關節腫脹度顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠的關節腫脹度比較

與正常對照組比較：1)P<0.05；與模型對照組比較：2)P<0.05；與甲氨蝶呤組比較：3)P<0.05；與用藥14 d比較：4)P<0.05

2.3各組關節病理情況對比正常對照組大鼠的關節結構正常，關節軟骨正常，軟骨細胞無壞死，關節腔間隙正常；模型對照組大鼠關節軟骨面破壞明顯，大量軟骨細胞出現壞死、腫脹，關節腔間隙狹窄；滑膜增厚、腫脹，細胞呈多層排列，滑膜中可見新生血管翳。甲氨蝶呤組大鼠關節軟骨面受到破壞，部分軟骨細胞出現壞死、腫脹，關節腔間隙稍變狹窄，滑膜增生，且部分滑膜中可見新生血管翳。補腎祛寒治尪湯組大鼠關節軟骨面受到破壞，少量軟骨細胞出現壞死、腫脹，關節腔間隙稍變狹窄，滑膜增生，少量滑膜中可見新生血管翳。

2.4各組血清IL-1、IL-2及TNF-α水平比較用藥28 d后，模型對照組IL-1、IL-2及TNF-α水平顯著高于其他3組(P<0.05)，甲氨蝶呤組和補腎祛寒治尪湯組IL-1、IL-2及TNF-α水平顯著高于正常對照組，補腎祛寒治尪湯組IL-1、IL-2及TNF-α水平顯著低于甲氨蝶呤組，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2　各組大鼠血清IL-1，IL-2及TNF-α水平比較

與正常對照組比較:1)P<0.05；與模型對照組比較:2)P<0.05；與甲氨蝶呤組比較:3)P<0.05

3　討　論

RA是一種進展性骨破壞的骨科疾病，在正常人體內，骨組織可以通過正常的重塑過程對自身的微損傷進行修復，維護骨骼結構的正常，保證骨骼載荷能力，但在RA患病關節可產生細胞水平和分子水平的物質介質，來干擾重塑過程，并且對骨組織進行破壞，其中破骨細胞的異常表達與骨組織的破壞有直接的關系〔6〕。中醫認為RA屬于尪痹類疾病，主要由于患者體內濕邪入侵、正氣不足，導致關節脈絡處出現風濕寒熱，脈絡受阻，進一步導致氣血運行受阻，最終關節出現僵硬、腫脹、疼痛的病態，而治療的思路主要為通絡活血、散風祛濕、除濕止痛、補腎驅寒〔7〕。西醫認為RA是屬于自身免疫性疾病，主要由于局部骨組織出現炎癥反應，導致骨組織周圍免疫微環境出現變化，進而導致骨組織出現病變，軟骨面被破壞，大量軟骨細胞出現壞死、腫脹，同時滑膜增厚、腫脹，出現新生血管翳〔8〕。

本次研究采用經典的膠原誘導方式成功建造RA大鼠模型，同時研究還發現，與模型對照組相比，在一般狀態和病理變化上甲氨蝶呤組和補腎祛寒治尪湯組均有所改善，這提示兩種用藥方法均能對RA模型大鼠起到一定的治療效果。本研究結果說明甲氨蝶呤和補腎祛寒治尪湯均能有效降低RA模型大鼠的關節腫脹度和血清中IL-1，IL-2及TNF-α水平，且補腎祛寒治尪湯的效果更好。究其原因，IL-1、IL-2及TNF-α均是炎癥相關因子，可以激活血管內皮細胞的活性，使內皮細胞黏附分子的表達增強，增加關節腔內白細胞的數量，同時刺激滑膜細胞和軟骨細胞，產生膠原酶，釋放骨鈣，進而對軟骨面造成破壞〔9〕。甲氨蝶呤是一種免疫抑制劑，具有免疫抑制作用，同時可以影響炎性細胞增殖和凋亡，降低關節滑膜組織基質金屬蛋白酶(MMPs)的水平，進而降低MMPs對軟骨面的破壞，改善RA癥狀，減少關節腫脹度〔10，11〕。補腎祛寒治尪湯由21味中藥組成，其中川斷和補骨脂具有補腎和強精壯骨的作用，骨碎補和淫羊藿具有溫補腎陽的作用，桂枝、獨活和威靈仙能有效祛除肢體風寒濕邪，其余藥物多具有散風、散寒、祛濕、壯骨等作用，連續用藥后可通絡活血、散風祛濕、補腎驅寒，進而改善RA大鼠癥狀，減少炎癥因子水平〔12〕。

綜上所述，補腎祛寒治尪湯能降低膠原誘導mRNA大鼠血清IL-1、IL-2及TNF-α水平，改善關節腫脹度，治療效果明顯。

1鄒惠美，成沛玉，王蓉，等.艾拉莫得治療大鼠膠原誘導性關節炎的療效及可能機制〔J〕.中國老年學雜志，2016；36(5)：1061-3.

2趙小民，黃興民，金海歐.補腎祛寒治尪湯輔以中藥熏蒸及穴位敷貼治療類風濕性關節炎臨床研究〔J〕.四川中醫，2017；36(1)：80-3.

3李連菊，王京旭.艾拉莫德分別聯合甲氨蝶呤和雙醋瑞因對難治性類風濕關節炎患者相關指標的影響比較〔J〕.中國藥房，2017；28(6)：769-72.

4葉霖，皮慧，王友蓮，等.蠲痹湯對膠原誘導性關節炎大鼠血清和滑膜Fas/FasL系統的影響〔J〕.山西醫藥雜志，2017；46(5)：503-6.

5焦樹德.焦樹德臨床經驗輯要〔M〕.北京：中國醫藥科技出版社，2001：37-42.

6Zhang L，Wang J，Zhang Q，etal.Factors associated with hand joint destruction in Chinese patients with rheumatoid arthritis〔J〕.BMC Musculoskelet Disord，2017；18(1)：211.

7董玢，婁利霞，韋翊麗，等.益氣活血解毒中藥對膠原誘導性關節炎大鼠NF-κB信號通路相關因子表達的影響〔J〕.北京中醫藥大學學報，2015；38(10)：686-9，702，721.

8張明生，穆永慧，陳清漢，等.骨髓間充質干細胞對膠原誘導的關節炎大鼠CD4+CD25+調節性T細胞的影響〔J〕.中華實驗外科雜志，2014；31(5)：1091-3.

9劉貴艷，邊森，李芳，等.骨髓間充質干細胞移植對膠原誘導關節炎大鼠血清及關節滑膜中白細胞介素-22及基質金屬蛋白酶-3表達的影響〔J〕.中華醫學雜志，2017；97(9)：698-702.

10羅東萍，劉秀梅，傅自力，等.他克莫司聯合甲氨蝶呤治療難治性類風濕關節炎臨床分析〔J〕.中華風濕病學雜志，2017；21(3)：185-7.

11趙小瑩，白寧.甲氨蝶呤聯合阿達木單抗治療類風濕關節炎療效觀察〔J〕.疑難病雜志，2014；13(4)：381-4.

12田鑫，嚴澤，王偉鋼，等.補腎祛寒治尪湯及其拆方對膠原誘導性關節炎大鼠治療作用的研究〔J〕.中華中醫藥雜志，2014；29(2)：629-31.