唑來(lái)膦酸對(duì)乳腺癌小鼠的抑瘤作用

楊　超　李　林　郭慶軍　劉運(yùn)江　

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院乳腺中心，河北　石家莊　050011)

1石家莊市人民醫(yī)院乳腺科2河北醫(yī)科大學(xué)教務(wù)處

乳腺癌致死原因主要為復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。采用化療輔助治療乳腺癌可將亞臨床微小轉(zhuǎn)移灶有效殺滅，減少?gòu)?fù)發(fā)率、死亡率，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率亦較高，而對(duì)于骨轉(zhuǎn)移的治療主要有介入、藥物治療或放療。唑來(lái)膦酸是目前治療骨轉(zhuǎn)移比較常用的藥物，效果顯著。有研究表明，唑來(lái)膦酸同時(shí)具有抗骨轉(zhuǎn)移和抗腫瘤效果〔1〕。本研究對(duì)4T1皮下移植瘤小鼠給予唑來(lái)膦酸聯(lián)合多西他賽治療，觀察其抑制腫瘤療效。

1　材料和方法

1.1材料4T1鼠系乳腺癌細(xì)胞株、多西他賽注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字H20052068，深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè))；注射用唑來(lái)膦酸(注冊(cè)證號(hào) H20140218，Novartis Pharma Schweiz AG)；IRDye 800CW EGF探針(美國(guó)LICOR公司)。

1.2試驗(yàn)方法選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期4T1細(xì)胞混懸液，將其在BALB/c小鼠右腋乳墊區(qū)進(jìn)行接種，單只腫瘤細(xì)胞混懸液劑量為0.1 ml(1×106個(gè))。1 w后可觸及皮下腫瘤時(shí)證明已完成小鼠腫瘤模型種植，腫瘤體積為150～200 mm3時(shí)將其隨機(jī)分組。隨機(jī)將32只小鼠隨機(jī)平分為A、B、C、D組，其中A組作為對(duì)照，于小鼠腹腔注射0.2 ml生理鹽水；B組采用唑來(lái)膦酸注射，與每只小鼠皮下注射5 μg唑來(lái)膦酸；C組采用多西他賽注射，每只小鼠腹腔注射15 mg/kg多西他賽；D組采用唑來(lái)膦酸和多西他賽聯(lián)合注射，首先腹腔注射15 mg/kg多西他賽，然后在同一只小鼠皮下注射5 μg唑來(lái)膦酸，以上4組均每周注射2次，共3 w。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1小鼠腫瘤重量、抑瘤率的測(cè)定計(jì)算腫瘤形成時(shí)，每3 d采用電子天平測(cè)量單只鼠重量，將小鼠處死后徹底剝離瘤體，然后稱腫瘤重量和抑瘤率。B、C、D組抑瘤率分別為(A組腫瘤平均值-本組腫瘤重量平均值)/A組腫瘤平均值×100%。唑來(lái)膦酸和多西他賽聯(lián)合用藥對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞株抑制效果評(píng)估根據(jù)金正均Q值法〔8〕，即Q=E(a+b)/(Ea+Eb-Ea×Eb)，其中Ea為唑來(lái)膦酸對(duì)腫瘤抑制率，Eb為多西他賽對(duì)腫瘤抑制率，E(a+b)聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤抑制率。當(dāng)0.851.15時(shí)藥物聯(lián)合為協(xié)同效果，Q<0.85時(shí)藥物聯(lián)合為拮抗效果。

1.3.2小鼠活體移植瘤熒光成像注射藥物后1 d，將EGF探針通過(guò)小鼠尾靜脈進(jìn)行注入，然后對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，在下肢肌肉通過(guò)選用氯胺酮注射麻醉小鼠，起效且滿意后把小鼠放入成像儀內(nèi)并固定，在成功標(biāo)記后的10 min、24 h、48 h、72 h進(jìn)行成像，然后對(duì)小鼠進(jìn)行瘤體、臟器解剖。

1.3.3瘤體細(xì)胞凋亡率測(cè)定取解剖后流體邊緣新鮮組織，將其置于70%酒精內(nèi)24 h，然后將其取出并制作成單細(xì)胞懸液，通過(guò)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例。

1.3.4小鼠轉(zhuǎn)移灶計(jì)數(shù)及臟器組織病理觀察對(duì)小鼠的臟器和瘤體進(jìn)行解剖，若觀察發(fā)現(xiàn)有肺臟轉(zhuǎn)移病灶時(shí)先行生理鹽水清洗，然后在顯微鏡下記錄肺臟表面轉(zhuǎn)移灶數(shù)量，將瘤體和除肺臟以外的其他臟器放入10%中性甲醛溶液中，制成石蠟塊。石蠟切片，HE染色肝、肺臟、脊柱和腫瘤，顯微鏡觀察其組織病理狀態(tài)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1各組腫瘤體積、腫瘤重量及抑瘤率比較4組荷瘤小鼠經(jīng)處理后腫瘤體積增大緩慢，D組及C組腫瘤體積顯著小于A組(P<0.05)、B組腫瘤體積略小于A組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，D組腫瘤體積明顯小于C組(P=0.011)，見(jiàn)表1。將小鼠處死并剝離完整腫瘤進(jìn)行重量測(cè)定，B、C、D組抑制瘤率的Q值均>1.15。B組與A組腫瘤重量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C組、D組腫瘤重量明顯小于B組，D組明顯小于C組(P<0.05)，C組(26.5%)、D組(34.9%)抑瘤率明顯大于A組(5.2%，P<0.05)，D組抑瘤率明顯大于C組(P<0.05)，按照Q值>1.15可判定D組聯(lián)合用藥具有顯著協(xié)同作用。

表1　各組腫瘤體積、腫瘤重量比較

與A組比較：1)P<0.05，與B組比較：2)P<0.05，與C組比較：3)P<0.05

2.2各組活體移植瘤熒光成像C組、D組的腫瘤熒光密度平均值(3.12±0.28，2.11±0.23)明顯小于A組(6.61±0.22，P<0.05)，B組腫瘤熒光密度平均值(6.32±0.39)略小于A組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，D組腫瘤熒光密度平均值顯著小于C組(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.3各組移植瘤細(xì)胞凋亡率及肺臟轉(zhuǎn)移灶數(shù)量比較D組細(xì)胞凋亡率〔(19.15±0.87)%〕顯著高于A、B、C組〔(10.38±0.74)%、(11.21±0.45)%、(13.23±0.62)%，P<0.05〕；B組、C組細(xì)胞凋亡率略高于A組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。C組、D組轉(zhuǎn)移灶數(shù)量(17.13，7.38)顯著小于A組、B組(40.38，36.12，P<0.05)。B組與A組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4各組臟器組織病理學(xué)觀察解剖小鼠后可見(jiàn)雙肺轉(zhuǎn)移，未發(fā)現(xiàn)腹腔腹水及肝、骨轉(zhuǎn)移。HE染色光鏡可見(jiàn)A組癌巢境界清晰，腫瘤細(xì)胞呈條、索狀，細(xì)胞核異型明顯；B組、C組、D組可見(jiàn)略增大的腫瘤細(xì)胞，少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)固縮、裂解，最終演變?yōu)榈蛲觥乃赖募?xì)胞。腫瘤內(nèi)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死組織，纖維化明顯，表明腫瘤生長(zhǎng)受抑制，見(jiàn)圖2。

圖1　各組活體移植瘤熒光成像

圖2　各組臟器組織病理學(xué)觀察

3　討　論

唑來(lái)膦酸對(duì)腫瘤引發(fā)的骨轉(zhuǎn)移具有顯著的治療效果，有資料表明，唑來(lái)膦酸較2代雙膦酸鹽藥物比較具有起效快、緩解率高、持續(xù)緩解時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)〔2〕。本研究顯示，唑來(lái)膦酸對(duì)代謝性骨病具有明顯的治療效果，其抗腫瘤作用顯著，其可在微摩爾濃度下對(duì)RhoA進(jìn)行抑制、使趨化因子受體有所下調(diào)、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的侵襲作用〔3〕。唑來(lái)膦酸可能通過(guò)對(duì)MDC1基因mRNA表達(dá)進(jìn)行下調(diào)，破壞DNA修復(fù)機(jī)制，引發(fā)細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生抑瘤效果〔4〕。唑來(lái)膦酸可“靶向”作用于骨骼系統(tǒng)，其可首先與骨表面相結(jié)合，而對(duì)除骨系統(tǒng)以外的軟組織腫瘤抗腫瘤能力較低。本研究顯示多西他賽和唑來(lái)膦酸聯(lián)合應(yīng)用具有更為突出的腫瘤抑制作用；與相關(guān)臨床研究結(jié)果相符〔5，6〕。

輔助化療可將乳腺癌患者體內(nèi)無(wú)法臨床識(shí)別的微小轉(zhuǎn)移灶及殘余病灶進(jìn)行有效消滅。并且對(duì)內(nèi)臟轉(zhuǎn)移的阻止具有一定的作用。本研究證明多西他賽聯(lián)合唑來(lái)膦酸具有較好的抗腫瘤療效，對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲具有較好的降低或滅活作用，乳腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程有所減慢，使小鼠生存無(wú)進(jìn)展期得到延長(zhǎng)。

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