谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶M1多態(tài)性及HPV16感染與宮頸癌的關(guān)系

王　靜　王　濤　宋　潔　韓彥龍　代海兵　鄧代千　卜曉波

(牡丹江醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室,黑龍江　牡丹江　157011)

據(jù)報(bào)道，人乳頭瘤病毒(HPV)感染可顯著提高宮頸癌的發(fā)病率，HPV16是我國宮頸癌的主要感染型別〔1〕。患者感染后易患尖銳濕疣，宮頸癌患者中約有60%患有尖銳濕疣〔2〕。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)是調(diào)節(jié)體內(nèi)細(xì)胞代謝的主要Ⅱ相代謝酶，能夠幫助細(xì)胞代謝毒素，抵抗損傷。在抗腫瘤藥物治療過程中，GST促進(jìn)藥物代謝，減少化療藥物對細(xì)胞的毒性，使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥傾向。GST主要包括GSTM1、GSTT1、GSTP1，研究表明這3種轉(zhuǎn)移酶在人群中存在多態(tài)性〔3〕。目前研究最多的是GSTM1，已有研究表明GSTM1純合缺陷型(GSTM1 null)參與肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等的形成和臨床轉(zhuǎn)歸〔4,5〕，但GSTM1基因型與宮頸癌的發(fā)生關(guān)系尚未明確，并且GSTM1基因型聯(lián)合HPV16與宮頸癌的發(fā)病率關(guān)系鮮有報(bào)道。本研究主要探討GSTM1多態(tài)性及HPV16感染與宮頸癌的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1一般資料見表1。選取2014年6月至2015年6月于牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院治療的116例宮頸癌患者作為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理學(xué)確診為宮頸癌；(2)均為首次患上宮頸癌；(3)患者已同意公開個(gè)人資料和病情，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他慢性病如高血壓、糖尿病者；(2)患有其他腫瘤者。另選取醫(yī)院同時(shí)期診斷為子宮肌瘤的116例患者作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床上經(jīng)B超確診為子宮肌瘤；(2)能理解并獨(dú)立完成問卷調(diào)查；(3)患者已同意公開個(gè)人資料和病情，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)孕婦及其他癌癥患者；(2)合并其他慢性病如高血壓、糖尿病者。病例組年齡37～71歲，平均(51.34±10.25)歲；對照組年齡39～68歲，平均(49.53±5.75)歲，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.173，P=0.224)。兩組民族、婚姻狀況、籍貫、職業(yè)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1　兩組人口學(xué)特征比較〔n(%),n=116〕

1牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院超聲科

1.2標(biāo)本采集入院治療前空腹采集全血5 ml，以3 000 r/min離心10 min后保留血凝塊，凍存于-80℃；用宮頸刷對宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行采集，將其浸泡在PBS(pH7.0)液中，在12 h內(nèi)3 000 r/min離心15 min富集細(xì)胞，于-80℃環(huán)境下保存。

1.3實(shí)驗(yàn)方法HPV的DNA從已富集的細(xì)胞中提取，方法采用多重聚合酶鏈反應(yīng)(Multiplex PCR)和熱啟動(dòng)技術(shù)，在預(yù)變性之后再加DNA聚合酶，檢測HPVl6 DNA及其癌基因；人基因組DNA從血凝塊中提取，GSTMl基因多態(tài)性的檢測采用多重PCR技術(shù)。

1.3.1樣本DNA的提取用TENNS裂解液(20 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl pH=8.0、10 mmol/L EDTA、0.5%十二烷基磺酸鈉(SDS)裂解血凝塊，經(jīng)蛋白酶K(Merck，Germany)處理、55℃過夜孵育、異丙醇沉淀、75%乙醇洗滌，提取DNA。用相同方法從宮頸脫落細(xì)胞中提取HPV-DNA。

1.3.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)用PCR儀(Eppendorf)擴(kuò)增血凝塊中DNA的GSTM1，上游引物，下游引物，獲得片段大小為218 bp，Albumin作為內(nèi)參基因。PCR方法擴(kuò)增宮頸脫落細(xì)胞DNA中HPV16 E6區(qū)，上游引物，下游引物，β-globin作為內(nèi)參基因。引物均訂購于上海生物工程公司。TaqDNA聚合酶、10倍緩沖液、10 mmol/L dNTP、25 mmol/L MgCl2均購自Invitrogen。

1.3.3電泳用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，每孔上樣量為10 μl,Marker(Takara，Japan)上樣量為3 μl。50 V電泳40 min，將電泳結(jié)果在VILBER CV-A450凝膠成像儀紫外燈下成像。

1.3.4結(jié)果判定HPV陽性判定標(biāo)準(zhǔn)如下:取10 μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，按照5∶1(v∶v)與上樣緩沖液均勻混合，取少量混合液置于1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/ml EB)板，電壓50 V，40 min后取出，與標(biāo)準(zhǔn)分子量進(jìn)行比較，通過凝膠成像儀紫外燈觀察圖片。HPV16 E6的目的基因片段為208 bp，若HPV16 E6基因?yàn)殛栃詣tHPV16也判為陽性。GSTM1基因型判定：取10 μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入上樣緩沖液2 μl，均勻混合，取少量混合液置于1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/ml溴化乙啶)，電壓50 V，30 min后取出，與標(biāo)準(zhǔn)分子量進(jìn)行比較，通過凝膠成像儀紫外燈觀察。GSTM1目的基因片段為219 bp。如有350 bp條帶則可判定PCR擴(kuò)增成功：有219(480)bp條帶則說明GSTM1基因存在即非空白型(nonull型)，無219(480)bp條帶則為GSTM1基因純合缺失即空白型(null型)。

2　結(jié)　果

2.1GSTM1基因多態(tài)性與宮頸癌的關(guān)系病例組GSTM1 null型占比〔59.48%(69/116)〕顯著高于對照組〔41.38%(48/116);χ2=7.604,P=0.006〕。

2.2HPV16感染與宮頸癌的關(guān)系以HPV16 E6區(qū)為檢測片段，病例組HPV16陽性率〔65.52%(76/116)〕明顯高于對照組〔27.59%(32/116)；χ2=33.539,P=0.001〕。

2.3GSTM1基因多態(tài)性聯(lián)合HPV16感染與宮頸癌的關(guān)系GSTM1 null型聯(lián)合HPV16陽性者宮頸癌的發(fā)病率顯著高于僅GSTM1 null型者或僅HPV16陽性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2　兩組GSTM1基因多態(tài)性聯(lián)合HPV16感染患病率比較〔n(%),n=116〕

與GSTM1 null型且HPV16陰性者比較：1)P<0.05;與GSTM1 nonull型且HPV16陽性者比較：2)P<0.05

3　討　論

長期感染HPV是宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素，宮頸癌患者中約有60%感染HPV。HPV感染中，HPV16和18是高風(fēng)險(xiǎn)型別〔6〕。HPV E6和E7是主要的病毒基因，在病毒合成過程中，這兩個(gè)病毒基因表達(dá)明顯增高〔7〕。Mattoscio等〔8〕發(fā)現(xiàn)HPV E6和E7蛋白選擇性抑制自噬體與溶酶體融合而負(fù)向影響自噬過程，降低了腫瘤抑癌基因p53表達(dá)下調(diào)，引起UBC9上調(diào)。UBC9是細(xì)胞功能必需的調(diào)節(jié)因子，它的過表達(dá)引起細(xì)胞抗凋亡能力增加，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤形成。

人類基因存在大量遺傳多態(tài)性，多篇文獻(xiàn)報(bào)道單個(gè)核酸多態(tài)性(SNP)導(dǎo)致基因表達(dá)缺失，嚴(yán)重影響疾病的發(fā)生發(fā)展〔9，10〕。GST是人類體細(xì)胞中不可或缺的酶類，由細(xì)胞內(nèi)一系列催化和非催化蛋白組成。GSTs參與多種腫瘤的發(fā)展，涉及細(xì)胞毒性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化、內(nèi)源性活性氧的降解，其SNP位點(diǎn)能夠引起完全或選擇性酶活性缺失，可能導(dǎo)致細(xì)胞對環(huán)境或氧化壓力的敏感和異變。近期，有文獻(xiàn)報(bào)道GSTs通過部分蛋白間相互作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡〔11〕，其中GSTM1的作用最為明顯。而GsTMl基因缺失可導(dǎo)致體內(nèi)致突變物和致癌物的水平受到影響，其是造成細(xì)胞基因突變的主要原因之一，同時(shí)HPV通過與宿主細(xì)胞整合可導(dǎo)致DNA發(fā)生突變，這也是引發(fā)宮頸癌的主要因素之一。在體內(nèi)，GSTs代謝酶可通過正常代謝酶活性阻止體細(xì)胞的DNA發(fā)生突變，防止HPV和宿主細(xì)胞整合，即使HPV和宿主細(xì)胞發(fā)生整合，也可以對受損DNA的修復(fù)產(chǎn)生促進(jìn)作用。本研究顯示病例組GSTM1 null型占比為59.48%，對照組GSTM1 null型占比為41.38%，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示GSTM1純合缺失型與宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān)。同時(shí)，病例組HPV16陽性率為65.52%，對照組HPV16陽性率僅為27.59%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示HPV16感染可能是宮頸癌發(fā)病率的主要危險(xiǎn)因素之一。另外，GSTM1 null型且HPV16陰性者宮頸癌患病率為12.93%，HPV16陽性且GSTM1 nonull型宮頸癌患病率為18.97%，而GSTM1 null型且HPV16陽性者宮頸癌患病率高達(dá)46.55%，GSTM1 null型聯(lián)合HPV16陽性者宮頸癌的發(fā)病率顯著高于僅GSTM1 null型者或僅HPV16陽性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示GSTM1純合缺失型與 HPV16感染可能存在協(xié)同作用，兩者聯(lián)合可能大大提高宮頸癌的發(fā)生率。HPV16感染細(xì)胞后整合到宿主基因組中，GSTM1酶促進(jìn)斷裂的宿主基因修復(fù)，降低HPV16病毒的嵌入。GSTM1純合缺失導(dǎo)致酶活性缺失，基因不能及時(shí)修復(fù)，增加了HPV16病毒整合到宿主基因的概率。HPV16感染引起的細(xì)胞氧化壓力和炎癥反應(yīng)，需要GSTM1酶的降解和清除，GSTM1純合缺失型導(dǎo)致細(xì)胞對HPV16感染產(chǎn)生異變，趨向癌化。因此，GSTM1純合缺失型作為個(gè)體化的基因背景，能夠幫助HPV16感染的細(xì)胞抗擊炎癥反應(yīng)而得以存活。

綜上所述，GSTM1純合缺失型與 HPV16感染可能存在協(xié)同作用，兩者聯(lián)合作用顯著增加了宮頸癌的患病率。因此檢測GSTM1基因型、早期篩查及防治HPV感染，同時(shí)也應(yīng)針對HPV感染等高危人群進(jìn)行宮頸癌防治知識(shí)的宣教，對實(shí)現(xiàn)宮頸癌的“三早”預(yù)防，降低宮頸癌發(fā)病率具有重要意義。

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