茶尺蠖幼蟲取食提高茶樹兒茶素代謝響應強度

冉偉，張瑾，張新，藺松波, 孫曉玲*

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茶尺蠖幼蟲取食提高茶樹兒茶素代謝響應強度

冉偉1,2，張瑾1,2，張新1,2，藺松波1,2, 孫曉玲1,2*

1. 中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008； 2. 農業部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，浙江 杭州 310008

研究了茶尺蠖幼蟲為害茶樹葉片對兒茶素合成途徑的影響。采用3齡茶尺蠖幼蟲取食茶樹新梢芽下第二葉，測定了兒茶素合成相關基因的表達水平和兒茶素含量。研究結果表明，與對照相比，茶尺蠖幼蟲為害后3、6、12?h顯著誘導了基因的相對表達水平，且在為害后3?h和12?h達到了極顯著差異。基因在茶尺蠖為害后6?h和12?h，與對照具有顯著差異。茶尺蠖幼蟲為害后24?h顯著誘導了沒食子酸、沒食子兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子酸酯含量的升高，而茶尺蠖為害后48?h僅沒食子酸和沒食子兒茶素的含量顯著高于對照；兒茶素、表沒食子兒茶素和沒食子兒茶素沒食子酸酯在茶尺蠖為害后24?h和48?h均沒有被顯著誘導。上述結果表明茶尺蠖幼蟲為害提高了茶樹兒茶素合成途徑的代謝強度和兒茶素類化合物的積累。

茶尺蠖；取食；兒茶素；誘導；茶樹

茶樹是我國重要的木本經濟作物之一，富含茶多酚、咖啡堿和類黃酮類衍生化合物。兒茶素類是茶多酚的重要組成部分，是類黃酮衍生化合物的次生代謝產物，其含量約占鮮葉茶多酚總量的80%[1]。大量研究結果表明，茶多酚類物質具有顯著的抑菌效果[2-5]。例如，Aditi等[5]研究了兒茶素類化合物對李斯特菌（）、銅綠假單胞菌（）、蠟狀芽孢桿菌（）、金黃色葡萄球菌（）和大腸桿菌（）等病原菌菌絲生長的抑制作用，結果發現表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和表沒食子兒茶素（EGC）對上述病原菌均具有較好的抑菌效果。Wang等[6]發現，EGCG和兒茶素（C）對于茶樹炭疽病病原菌（）的生長具有顯著抑制效果。盡管很多研究結果證實，多酚類化合物在植物抗蟲防御方面具有重要作用[7-8]，但是，關于茶樹多酚類化合物抗蟲功能的研究僅見少量報道，并且都集中于總茶多酚的抗蟲方面[9-12]。目前，茶樹多酚類化合物中具體哪種成分發揮了抗蟲作用則尚不明晰。

茶尺蠖（Prout）廣泛分布于我國各個茶區，是茶園中發生普遍且為害嚴重的食葉性害蟲種類之一，是當前制約我國茶葉安全生產的重要因素。茉莉酸和乙烯信號轉導途徑與植物次級代謝產物的合成密切相關，研究發現這兩條途徑可被茶尺蠖幼蟲取食所激活[13-14]。業已證明，茶尺蠖幼蟲取食可誘導茶樹釋放大量揮發性化合物，這些揮發物可被天敵、害蟲及鄰近植物所識別，從而在害蟲和天敵種群調控以及誘導鄰近植株防御反應中發揮作用[15-17]。然而，有關茶尺蠖幼蟲取食誘導茶樹產生的有毒代謝物質或防御蛋白等方面的研究尚鮮見報道，尤其是具有廣泛抗菌作用的兒茶素類化合物是否可被茶尺蠖幼蟲取食所誘導則尚未見報道。鑒于此，本文擬通過比較健康茶苗與茶尺蠖幼蟲為害茶苗葉片中兒茶素合成途徑中無色花色素還原酶基因（，登錄號：AY169404）和花青素還原酶基因（，登錄號：AY641729）轉錄水平的表達量差異，以及不同處理茶樹葉片中兒茶素類組分的含量差異，確定茶尺蠖幼蟲為害對茶樹兒茶素代謝途徑的影響，以期為從茶尺蠖幼蟲為害誘導的兒茶素類化合物中篩選出具有抗蟲作用的功能物質提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試茶苗

供試茶苗為3年生龍井43扦插苗，于(25±2)℃溫室中培養，光周期為12?L︰12?D，相對濕度60%~70%，每4個月施1次有機肥。選擇長勢良好、無病蟲害茶苗用于實驗。

1.2 供試茶尺蠖

茶尺蠖幼蟲飼養于智能型人工氣候室，溫度(25±2)℃，相對濕度60%~80%，光周期為14?L︰10?D，飼以新鮮茶樹葉片。室內飼養一代后的3齡幼蟲，饑餓3?h后用于茶苗處理。

1.3 茶苗處理

在(25±2)℃，相對濕度60%~80%，光周期為14?L︰10?D的條件下進行茶苗處理。將2頭3齡茶尺蠖幼蟲接種于茶樹新梢芽下第二葉，套以透氣網袋防止逃逸；僅套網袋不接蟲的葉片作為對照。處理3、6、12?h后取芽下第二葉用于基因表達量分析。處理24、48?h后的芽下第二葉用于兒茶素含量的測定。每個處理6個重復。

1.4 基因表達量分析

采用TIANGEN試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）進行總RNA提取和反轉錄，具體步驟按照產品說明進行操作。以為內參基因，引物序列見表1。定量檢測方法參照SYBR Premix ExTaq試劑盒（TAKARA，寶日醫生物技術有限公司，北京）的操作步驟，采用20?μL體系于LightCycler96實時熒光定量PCR儀上檢測目的基因的表達水平。反應條件為95℃預變性5?min；95℃變性5?s，60℃退火30?s，40個循環。每個樣品重復3次，反應結束后收集CT值進行分析。

1.5 兒茶素類含量測定

兒茶素類含量分析采用高效液相法[18]。準確稱取0.1?g茶粉（液氮下研磨），加入1?mL 80%甲醇水溶液，震蕩10?min（1?200?r·min-1），然后超聲5?min（100?Hz，25℃），再震蕩5?min后，離心30?min（–4℃，12?000?r·min-1），取上清液過0.22?μm濾膜，所得濾液用于分析。

1.6 數據分析

對照與處理之間和相對表達量及兒茶素組分含量的差異顯著性均采用獨立樣本檢驗進行分析。統計分析軟件采用SPSS18.0，在Windows 10操作系統下進行。

表1 qRT-PCR引物

注：與對照相比，*P<0.05，**P<0.01，下同。Compare with CK, *P<0.05，**P<0.01. The same as follow.

2 結果分析

2.1 幼蟲為害誘導CsLAR和CsANR的表達水平比較

茶尺蠖幼蟲為害可顯著誘導和在轉錄水平上的表達量。其中，的相對表達量在為害后3、6、12?h分別比對照提高2.77、3.18和3.13倍，且為害后3?h、6?h和12?h與對照相比具有顯著性差異，在3?h和12?h達到了極顯著差異；的相對表達量在為害后3、6?h和12?h分別比對照提高2.30、2.16和3.67倍，且為害后6?h和12?h與對照相比具有顯著性差異。

2.2 幼蟲為害誘導茶樹葉片兒茶素類化合物的積累

茶尺蠖幼蟲為害顯著誘導茶樹葉片沒食子酸（GA）、沒食子兒茶素（GC）、表兒茶素（EC）、EGCG和ECG含量的升高，但是C、EGC和沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）的含量不受茶尺蠖幼蟲為害所誘導。其中，GA、GC、EC、EGCG和ECG含量在為害后24?h即達到顯著差異，而為害后48?h僅有GA和GC的含量顯著高于對照（圖2）。

圖2 茶尺蠖幼蟲為害對茶樹兒茶素類化合物含量的影響

3 討論

植物在與植食性昆蟲的長期協同進化過程中，形成了一套有效的防御體系。在這一防御體系中，包含了植物組成抗性（Constitutive resistance）和誘導抗性（Induced resistance）兩個方面。植物被植食性昆蟲為害誘導后，通過積累有毒代謝物或防御蛋白對害蟲進行直接防御，也可通過釋放蟲害誘導揮發物引誘植食性昆蟲的天敵前來捕食或寄生而進行間接防御[19-21]。植物多酚類能被植食性昆蟲取食所誘導，并參與到植物的抗蟲防御中[8, 22-23]。例如，抗蚜蟲小麥葉片總酚和鄰二羥基苯酚的含量顯著高于感蟲品種，并且抗蟲品種在蚜蟲為害后更早和更強地誘導了查耳酮合成酶的活性和葉片多酚含量[8, 23]；棉花多酚含量與棉鈴蟲抗性也呈現正相關，且隨棉酚劑量增加，棉鈴蟲幼蟲死亡率增加、幼蟲歷期延長、蛹重逐漸減少、成蟲產卵量降低[24]。兒茶素類是茶樹中重要的酚類化合物，并對多種病原菌具有抑制生長的作用[5-6]。和是茶樹類黃酮代謝途徑的關鍵控制基因，無色花色素可以被轉化為C、GC，被轉化為EC和EGC[25]。本研究發現茶尺蠖幼蟲為害后3、6、12?h可誘導相對表達水平的顯著升高，且在3?h和12?h達到極顯著差異，而的表達量在茶尺蠖為害后6?h和12?h與對照具有顯著差異。根據上述結果，GC在茶尺蠖幼蟲為害后24?h和48?h均顯著高于對照，而C卻始終與對照無顯著差異，我們推測茶尺蠖幼蟲為害誘導表達的僅使GC的含量顯著積累，卻并不影響C的含量。而ECG和EGCG在茶尺蠖幼蟲為害后24?h被顯著誘導，EC和EGC分別作為ECG和EGCG合成的前體物質，可能更早被的上調誘導合成，但新合成的EC和EGC又馬上與1--沒食子酰基-β-葡萄糖（βG）發生酯化反應生成了EGCG和ECG，并進一步參與到其他反應中，所以在茶尺蠖幼蟲為害后48?h EGCG和ECG的含量與對照無顯著差異。綜上，茶尺蠖幼蟲為害影響了茶樹兒茶素代謝途徑（圖3）。

圖3 茶尺蠖幼蟲為害對兒茶素代謝途徑的影響

眾所周知，多酚氧化酶（PPO）在植物抵御病原菌侵染和植食性昆蟲取食中發揮重要作用[26-29]，并且噴施茉莉酸甲酯和機械損傷都能顯著誘導植物葉片中PPO的活性[30-33]。前期研究發現，茶樹葉片PPO對茶尺蠖具有直接防御作用，能顯著抑制茶尺蠖的生長發育[34]。有趣的是，茶尺蠖幼蟲為害茶樹葉片卻顯著降低了茶樹葉片PPO的活性，而兒茶素類作為多酚氧化酶的底物，在茶尺蠖幼蟲為害葉片中的含量卻顯著升高。并且酯型兒茶素類在茶尺蠖幼蟲為害后24?h的葉片中顯著高于對照，而為害后48?h的葉片中與對照卻無顯著差異，酯型兒茶素含量的這種變化是否與PPO活性降低具有相關性值得進一步研究。

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Infestation ofAffects the Catechin Metabolism in Tea Plants

RAN Wei1, 2, ZHANG Jin1, 2, ZHANG Xin1, 2, LIN Songbo1,2, SUN Xiaoling1, 2*

1. Institute of Tea Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China

In this study, the effect of feeding byon the catechin pathway of tea plant was analyzed. The transcriptional levels of catechin-related genes and the contents of individual catechins in the infested or intact leaves were measured. The transcriptional level ofin the infested leaves was significantly higher than that in the intact leaves 3, 6?h and 12?h after infestation. Meanwhile, the infestation ofalso significantly induced the expression level ofafter 6?h and 12?h. The contents of gallic acid, gallocatechin, epicatechin, epigallocatechin gallate and epicatechin gallate were significantly induced 24?h after infestation. Moreover, the contents of gallic acid and gallocatechin were also significantly induced 48?h after infestation. However, the infestation ofdidn’t induce the increases of catechin, epigallocatechin and gallocatechin gallate. In a word, the infestation ofaffected catechin metabolism in tea plant.

, infestation, catechins, induced,

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2018)02-133-07

2017-12-18

2018-01-16

公益性行業（農業）科研專項經費（201403030）、國家自然科學基金（31471784、31272053）、浙江省“151”人才工程資助項目

冉偉，男，碩士研究生，主要從事茶樹害蟲互作方面的研究。

xlsun1974@163.com