茶樹小G蛋白CsRAC5基因的克隆與低溫脅迫下的表達分析

葉小麗，潘俊廷，朱姣姣，疏再發，崔傳磊，邢安琪，農壽華，朱旭君，房婉萍，王玉花

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茶樹小G蛋白基因的克隆與低溫脅迫下的表達分析

葉小麗，潘俊廷，朱姣姣，疏再發，崔傳磊，邢安琪，農壽華，朱旭君，房婉萍，王玉花*

南京農業大學園藝學院，江蘇 南京 210095

小G蛋白是一類重要的信號轉導蛋白，參與植物的各項生命活動，但目前在茶樹中的研究尚少。本研究以茶樹品種龍井長葉為實驗材料，克隆獲得1個小G蛋白基因，命名為。序列分析顯示，含有597?bp，編碼198個氨基酸，具有Rho蛋白的保守結構域；序列多重比對發現，該序列與其他物種序列的一致性高達95.96%。CsRAC5蛋白質的相對分子質量為21.79?kDa，為親水性蛋白；煙草瞬時表達實驗顯示，CsRAC5定位于細胞膜和細胞核中。熒光定量PCR結果顯示，在茶樹中的表達具有明顯的組織特異性，其中在葉片中的表達最高，在花粉中的表達最低；低溫（4℃）脅迫抑制茶樹葉片中的表達。

茶樹；；生物信息學分析；低溫脅迫；表達分析

小G蛋白家族（Small GTPase family）是普遍存在于真核細胞中的1個GTP結合蛋白家族，是真核生物中成員數量較多的一類信號轉導蛋白，有100多種，參與調控細胞的多種生命活動[1-2]{!!! INVALID CITATION !!!, ;Bourne, 1990 #79}。根據序列結構和細胞功能的相似處，小G蛋白超家族可以分為Ras（Sarcoma）、Rho（Ras homolog）、Rab（Rat brain）、Arf（ADP ribosylation factor）和Ran（Ras-related nuclear）5個亞家族[1]。植物中存在一種特殊的小G蛋白ROPs（Rho-related GTPase from plants）是Rho家族成員，由于植物中ROPs跟Rho家族成員中Rac非常相似，所以植物中特有的一類小G蛋白Rac-like GTPase or ROPs（Rho-related GTPases from plants）（RAC/ROPs）也可以稱之為RACs[2]。ROP是植物中的分子開關，參與感受胞外刺激，如激素、病原體激發子以及非生物脅迫等信號，并且能夠通過不同的細胞內信號轉導來響應這些信號。

茶樹[(L.) O.Kuntze]作為南方丘陵的一種多年生經濟作物，性喜溫[3]。我國許多地區的茶樹受初冬驟至的寒流或早春“倒春寒”等氣候的影響，茶樹萌芽推遲，生長緩慢；零度以下的凍害使茶葉產量下降，成葉邊緣變褐，葉片呈紫褐色，嫩葉出現“麻點”、“麻頭”[4]，這些成為制約廣大茶區產業發展的重要問題。研究茶樹對低溫的響應機理對保障茶樹安全越冬、預防“倒春寒”和茶樹引種都具有重要意義。目前，雖然未見小G蛋白參與茶樹低溫脅迫的研究，但是低溫脅迫可以通過誘導一系列信號轉導途徑，與下游的順式作用元件特異性結合，激活下游與抗逆相關的基因的表達來提高植物的抗性。這些基因的表達受Ca2+調控[5]。一些二級信號分子，如ABA[6]、ROS[7]也可通過誘導細胞內Ca2+流動從而引發低溫脅迫信號應答。越來越多的研究表明ROPs參與細胞骨架的組織動態與囊泡運輸，響應激素信號[8-12]，保衛細胞開放和閉合[13]，H2O2的產生[14]。更重要的是植物特有蛋白家族RIC（ROP-interactive CRIB-containing protein）是RAC/ROP的下游效應因子[15]，AtROP1能夠激活AtRIC3通過一條Ca2+依賴的途徑導致F-肌動蛋白的分解[16]。所以我們推測小G蛋白與低溫脅迫之間可能存在相應的聯系。

本實驗從茶樹品種龍井長葉的cDNA中克隆得到1個小G蛋白基因，通過生物信息學的方法對其氨基酸序列進行比對分析，并采用熒光定量PCR，探討該基因在茶樹不同組織部位的表達差異和低溫脅迫下表達變化情況，為茶樹在低溫條件下的分子育種提供進一步的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本實驗選用江蘇省雅潤茶苗繁育中心兩年生龍井長葉（cv）水培苗為研究對象，取幼嫩葉提取RNA，用于后續克隆實驗。另外，取栽植于南京市中山陵茶廠的5年生龍井長葉的根、莖、葉、老葉、花、果實、種子和花粉，用于后續基因表達實驗。茶花采于2016年10月—11月上旬盛花期間，下午16~17時采摘處于蕾白期的花，花粉的收集方法參照陳暄等[17]報道的方法。2016年10月20日將茶苗放入RXZ型人工智能氣候箱，晝夜溫度25℃/20℃，光周期與暗培養周期為12?h/12?h，光照強度30?klx，相對濕度75%~80%，培養2周后將茶苗放入4℃人工氣候箱低溫處理。分別于處理0、1、4、8、12、24?h后取茶苗中部成熟葉片，放入液氮速凍，–70℃冰箱保存備用。

EASYspin plus植物RNA提取試劑盒和EASYspin植物快速提取試劑盒購于北京艾德萊生物科技有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs、Marker、PMD?19-T Vector、RNA酶抑制劑、SYBR?Premix Ex TaqⅡ、反轉錄試劑盒等均購于寶生物工程（大連）有限公司。Agarose Gel DNA Purification Kit購于美國OMEGA Biotek公司。其余試劑為國產分析純試劑。大腸桿菌菌株DH5α由南京農業大學茶葉科學研究所保存。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

利用EASYspin植物快速提取試劑盒，按照說明書提取龍井長葉幼嫩葉的總RNA，并利用NanoDrop測得RNA濃度，1%的瓊脂糖膠檢測RNA的完整性，觀察18?S、28?S條帶。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒反轉錄成cDNA。

1.3 CsRAC5基因的克隆

利用本課題組已有轉錄組數據庫[18]，通過Blast比對，將推測的ROP序列與擬南芥的11個ROP氨基酸序列進行比對，發現1個目標序列與擬南芥的AtRAC5（登錄號：AT1G75840）序列高度同源，命名其基因為。利用DNAMAN6.0設計ORF區全長引物，引物序列為-F：5′-ATGAGT GCTTCGAGGTTCATC-3′，-R：5′-ACAAGATACTGCAATTTTTTTG。PCR的擴增體系為20?μL：酶10?μL，ddH2O 7?μL，上游引物1?μL，下游引物1?μL，模板cDNA 1?μL。反應條件為：94℃預變性3?min；94℃變性30?s，56℃退火30?s，72℃延伸1?min，共35個循環；72℃延伸10?min。取5?μL產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。按照Agarose Gel DNA Purification Kit試劑盒說明書回收PCR產物，連接到PMD-19T載體，轉化到大腸桿菌DH5α。取部分菌液委托南京金斯瑞公司測序。

1.4 序列分析

將公司測序的結果，利用NCBI中的生物軟件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）進行比對分析。使用相關程序（https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）對獲得的氨基酸序列和蛋白序列進行BLAST比對搜索和保守結構域與功能域的預測；序列多重比對使用DNAMAN6.0；蛋白質的組成成分與理化性質使用EXPASY（http://www.expasy.org）軟件；ProtScale（http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）分析其親/疏水性質；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在線程序預測CsRAC5蛋白的α-螺旋、β-折疊和其他二級結構；利用COILS（http://embnet.vital-it.ch/ software/COILS_form.html）預測它們的卷曲螺旋（Coils）區域；利用TMHMM Server.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）預測它們的跨膜結構域；利用SignalIP4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）進行信號肽預測。利用TargetP1.1 Server- predition results（http://www.cbs.dtu.dk/services/ ChloroP）預測它們在細胞中的定位。利用Swiss-Model（http://www.Swissmodel.expasy.org）構建蛋白質的三維結構模型。

1.5 CsRAC5亞細胞定位

將不含有終止密碼子的連接到植物瞬時表達載體p576，構建由Ubiquitin啟動子啟動的pGreenⅡ-Hyg-UBQ10-RAC5-eGFP融合蛋白表達載體。采用凍融法將融合表達載體轉入農桿菌（）GV3101-pSoup中，參照Spaekes等[19]的方法侵染煙草表皮細胞，25℃暗培養3?d后使用共聚焦顯微鏡觀察熒光信號。

1.6 CsRAC5組織表達特異性與低溫處理下的表達分析

2 結果與分析

2.1 CsRAC5基因的擴增

通過本課題組原有的轉錄組數據，將推測的ROP序列與擬南芥的11個ROP氨基酸序列進行比對，發現一個目標序列與擬南芥的AtRAC5（登錄號：AT1G75840）序列高度同源。以龍井長葉的幼嫩葉cDNA為模板，以-F和-R引物，經過PCR擴增得到一個600?bp左右的片段（圖1），序列測定與分析結果表明，基因片段為597?bp，編碼198個氨基酸（圖2）。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 序列比對與進化樹分析

利用BLAST-conserved domains search對基因的氨基酸保守域預測（圖3），CsRAC5擁有Rop-like保守結構域，9~178之間是一個Rho結合域，Rho結構域中含有GTP/GDP結合區域、Effector（下游效應因子）區域，Rho插入區域、絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點，堿性氨基酸區域以及與堿性氨基酸區域緊鄰位于C末端保守的異戊烯基化位點等保守結構。符合小G蛋白家族基因的保守區域結構特性。

注：M表示marker，1表示CsRAC5基因。

注：下劃線標注的氨基酸序列為Rop-like結構域。Note: The amino acid sequences underlined mean Rop-like domain.

利用BLAST進行同源序列比對，將茶樹的基因與胡楊（）、巨桉（）、小果野芭蕉（）、油棕（）、芝麻（）RAC5進行多重序列比對，結果顯示同源性達95.96%（圖4）。

利用MEGA7.0軟件將CsRAC5與擬南芥11個RAC/ROP構建系統進化樹（圖5），結果表明CsRAC5與AtRAC5親緣關系最近，屬于RAC/ROP四類分類法中的第Ⅳ類,此類主要調控肌動蛋白骨架組裝、細胞的極性生長以及激素信號轉導等[23]。

圖3 CsRAC5的保守區預測

圖4 茶樹CsRAC5與其它物種的多序列比對

圖5 茶樹CsRAC5與擬南芥RAC/ROP基因的同源進化樹分析

2.2.2 氨基酸組成、理化性質分析及結構預測

根據BLAST同源比對的結果，挑選不同物種中ROP相似度較高的序列，利用ExPASy- ProtParam對挑選的序列進行氨基酸組成和理化性質的分析。結果顯示（表1），這些植物中小G蛋白的氨基酸數量為196~198，相對分子質量在21?500左右，理論等電點在9.3左右，正電荷氨基酸25左右，負電荷氨基酸17左右，不穩定系數在39左右，這些蛋白都屬于穩定蛋白，總平均疏水性（GRAVY）均為負值，表明這些蛋白均為親水性蛋白。

KinasePhos軟件分析顯示CsRAC5有11個絲氨酸（S）激酶、12個蘇氨酸（T）激酶、17個酪氨酸（Y）激酶潛在磷酸化位點，0個組氨酸（H）磷酸化位點。TMHMM跨膜結構預測顯示，CsRAC5不具備跨膜螺旋區。

Predict Protein蛋白質二級結構預測顯示，CsRAC5含有α-螺旋（Hh）34處，延伸鏈（Ee）61處，β-轉角（Tt）0處，無規則卷曲（Cc）103處，分別占總氨基酸的17.17%，30.81%，0，52.02%。另外，同源建模發現，CsRAC5蛋白與AtRAC5蛋白的相似性達到90%以上（圖6）。

2.2.3 CsRAC5的信號肽分析和亞細胞定位

SignalIP信號肽預測顯示，在CsRAC5中，C最大值出現在94位，該位置最可能出現剪切位點；S最大值出現在91位，表明該位置為信號肽部分，Y的最大值出現在94位。所以可以判斷最理想的剪切位點位置在93與94之間，成熟蛋白啟動的位置為94。CsRAC5蛋白質線粒體靶向肽（mTP）為0.142；葉綠體靶向肽（cTP）為0.086；分泌通路信號肽（SP）為0.367；其他形式的肽分別為0.601，說明其為其他形式的肽的可能性較大。

為了進一步闡明CsRAC5蛋白在何處發揮其生物學功能，利用農桿菌侵染煙草葉片，進行瞬時表達CsRAC5-eGFP融合蛋白。利用激光共聚焦顯微鏡對綠色熒光蛋白觀察發現，綠色熒光信號定位在細胞核和細胞膜中（圖7），我們推測CsRAC5可能在細胞核和細胞膜上行使生物學功能。

2.3 CsRAC5基因的組織特異性表達分析

提取龍井長葉的根、莖、葉、芽、花、果、花粉、花粉管的RNA，進行熒光定量PCR，分析在茶樹各組織中的相對表達水平，結果顯示，在葉片中的表達水平最高，其次是芽、莖、果、花、根、花粉、花粉管（圖8）。表明在茶樹各組織器官的表達呈現組織特異性。

圖6 CsRAC5的三維結構預測

注：A：明圖視野，B：熒光圖，C：疊加圖。Note: A: Bright field, B: Green fluorescence, C: Merge.

表1 不同物種中RAC氨基酸組成成分及理化性質分析

注：不同字母代表顯著性差異，下同。

2.4 低溫處理下CsRAC5表達量變化情況

低溫處理龍井長葉水培苗1、4、8、12、24?h后的表達量與對照（0?h）相比，發現的表達量呈現先下降后上升然后相對穩定的情況（圖9）。

3 討論

通過同源序列比對和RT-PCR的方法克隆得到茶樹1個小G蛋白基因，它具有典型的Rop蛋白的特征結構域，與其他植物中的Rop基因高度相似性。屬于P-loop_NTPase超家族，P-loop包含三核苷酸水解酶，具有Rop-like特異性結合位點。每個小G蛋白氨基酸包含7個典型的功能區，4個保守的鳥嘌呤核苷酸結合區域，多個與下游效應分子結合位點（GAP、GEF、GDI）以及Rho插入區和膜定位信號[8]。ROP GTPase在GDP結合的非活性形式和GTP結合的活性形式之間不斷轉化，其活性可以受到GEFs、GAPs、GDIs的精密調控[15, 24]。ROP通過這3種蛋白的調控，介導胞外信號到胞內的傳遞[25]。該超家族具有特定的核苷磷酸結合形式。在其保守區域內含有鳥苷酸和5個GTPase活化位點（GⅠ-GⅣ），并且包括1個效應器分子結合域E（effector domain）和C-末端的異戊烯基化位點，Rho Insert為Rho GTPase特有的結構，另外包括switchⅠ和switchⅡ2個開關轉換區域，為蛋白的2個表面環區，當圍繞著GTP的γ-磷酸根結合后，蛋白就會發生構象的改變，這讓鳥嘌呤核苷酸的結合區在空間上的結構更接近[25]。

圖9 低溫對茶樹CsRAC5表達水平的影響

生物信息學分析表明CsRAC5是非跨膜的分泌型蛋白，含有多個磷酸化位點和信號肽，表明它擁有細胞信號轉導功能，與茶樹的生命活動以及逆境脅迫和非逆境脅迫密切相關。同源性結果表明，與同源性最高。亞細胞定位分析CsRAC5蛋白定位在細胞膜和細胞核上。組織特異性結果發現該基因在葉片中的表達水平最高，花粉管中最低，這與其他物種中該基因的組織特異性表達量不盡一致[27]。

低溫處理抑制基因的表達，這一結果與王偉東等[18]的研究中低溫能夠抑制花粉管中該基因的表達以及Jin等[28]玉露桃冷害脅迫后ROP基因表達量顯著降低相一致，ROP基因與NADPH oxidase和CCR相互作用，參與植物的冷害脅迫。我們從在低溫處理過程中表達量先下降后上升，逐漸趨于平穩的表達趨勢推測可能參與了茶樹抵抗低溫脅迫的前期信號調控，是低溫脅迫下的一個短時應激蛋白，但具體調控機制還需要進一步研究。

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Cloning and Expression Analysis of Small GTPase () under Cold Stress in Tea Plant ()

YE Xiaoli, PAN Junting, ZHU Jiaojiao, SHU Zaifa, CUI Chuanlei, XING Anqi, NONG Shouhua, ZHU Xujun, FANG Wanping, WANG Yuhua*

College of Horticulture, Nangjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

Small GTPase binding proteinsare a kind of important signal transduction proteins, which are involved in various life activities of plants.However, few relative studies were reported in tea plants (). Here, a small GTPase binding protein namedwas cloned by using a cDNA template from tea cultivar ‘Longjingchangye’. The results showed that the length of its open reading frame (ORF) is 597?bp, encoding 198 amino acids.It has a conserved Rho domain which belongs to ROP family. Multiple alignment of CsRAC5 with homologue genes in other plant species showed that their identity could reach 95.96%. CsRAC5 is a hydrophilic protein with the theoretical relative weight of 21.79?kDa. The subcellular assay showed that CsRAC5 was localized in the nuclear and membrane. In addition, the results of RT-PCR analysis showed that the highest expression level ofwas in leaves but the lowest in pollen. Theexpression level ofwas decreased undercold stress.

,, bioinformatics analysis,cold stress, expression analysis

S571.1；Q52

A

1000-369X(2018)02-146-09

2017-10-09

2017-11-25

國家自然科學基金（31770733，31370014）、連云港市科技計劃項目（SF1502）、南京市科技計劃項目（201608068）

葉小麗，女，碩士研究生，主要研究方向為茶樹栽培育種。

wangyuhua@njau.edu.cn