茶樹兒茶素合成相關MYB轉錄因子生物信息學分析

張玥，胡雲飛，王樹茂，柯子星，林金科

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茶樹兒茶素合成相關MYB轉錄因子生物信息學分析

張玥，胡雲飛，王樹茂，柯子星，林金科*

福建農林大學安溪茶學院，福建 福州 350002

從茶樹（）轉錄組數據庫中獲得6個與兒茶素合成相關的MYB轉錄因子，對其進行蛋白理化性質與結構功能預測、核定位信號和蛋白保守結構域分析，通過同源分析構建系統發育樹。結果表明，與兒茶素合成相關的6個MYB蛋白都屬于親水性的非分泌蛋白，定位在葉綠體、線粒體和細胞核上，其空間結構主要是α-螺旋和β-轉角；保守結構域的分析發現除了comp159173_c0基因，其余5個都屬于SANT超家族基因成員。系統進化樹顯示6個MYB蛋白形成4個分支，顯示出各自間較遠的親緣關系。差異表達分析的結果進一步證實了6個MYB轉錄因子與兒茶素合成代謝的相關性。

兒茶素；MYB轉錄因子；生物信息學

茶葉中的兒茶素是2-苯基苯并吡喃的衍生物，是茶樹中最主要的黃烷醇類化合物，屬于類黃酮物質[1]。兒茶素含量占茶樹鮮葉干重的12%~25%，是茶葉中多酚類物質的主體成分，它們既是決定茶葉品質的關鍵因素，也是茶葉抗癌、抗炎癥等保健功效的主要成分[2]。近年來，隨著茶葉保健功效的闡明，對茶樹兒茶素和原花色素的生物合成途徑及分子調控機理的研究已成為國內外茶樹次生代謝領域研究的熱點。

轉錄因子是一類植物中普遍存在的調節蛋白，又稱為反式作用因子，即通過識別或結合真核基因啟動子區域中的順式作用元件，來激活或抑制靶基因的轉錄，在植物的生長發育[3-5]、生物與非生物脅迫應答[6-7]、激素應答[8]、次生代謝[9-11]等過程中起到調節和控制的作用。MYB類轉錄因子在植物的次生代謝中主要在苯丙素代謝途徑中發揮作用，該途徑的起始物質莽草酸通過莽草酸途徑產生苯丙氨酸，苯丙氨酸又在限速酶苯丙氨酸解氨酶的作用下，產生許多不同的次級代謝產物，包括兒茶素類化合物[12]。

迄今為止，茶樹兒茶素合成途徑中一些關鍵酶的基因已經被克隆，例如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查爾酮異構酶（CHI）、查爾酮合成酶（CHS）、二氫黃酮醇還原酶（DFR）、花青素還原酶（ANR）、花青素合成酶（ANS）、黃烷酮3-羥基化酶（F3H）等，并對這些酶與多酚合成之間的關系進行了初步的研究[13-17]。但兒茶素類化合物的種類多樣，合成途徑受到大量關鍵酶基因的影響，而這些酶基因的表達則受到相應轉錄因子的調控[18]。

諸多調控類黃酮次生代謝的MYB轉錄因子在植物中被發現。前期的研究在草莓、番茄、蘋果、土豆等植物中分離并克隆得到了調控花青素合成途徑的MYB蛋白[19-22]，在豆科植物、柿樹、楊樹等植物中分離克隆得到了調控原花色素合成代謝的MYB轉錄因子[23-25]，在擬南芥和葡萄中還克隆得到了一些調控黃酮醇代謝途徑的MYB轉錄因子[26-28]，最近的研究發現導入MYB、bHLB還可以激活黃烷醇類次生代謝途徑上結構基因的表達[29]。茶樹中關于類黃酮合成相關MYB轉錄因子的研究主要集中在對花青素合成代謝相關途徑的調控[30-31]，對兒茶素合成相關的MYB轉錄因子的功能研究則未見報道。本研究在前期對高酯型兒茶素轉錄組信息分析的基礎上，對之前課題組篩選出的6個與兒茶素總量、酯型兒茶素含量的關聯系數均在0.75以上的MYB轉錄因子[32]，采用生物信息學的方法，分析其蛋白質理化性質、進化關系、結構功能以及差異表達模式，為進一步研究茶樹兒茶素合成過程中相關的MYB轉錄因子功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

茶樹MYB序列來源于本課題組構建的轉錄組數據庫（NCBI：SRP059658），通過基因功能注釋和前期“茶樹芽葉兒茶素含量與轉錄因子MYB、bHLH關聯分析”[32]的研究，獲得6條與兒茶素總量、酯型兒茶素含量關聯系數均在0.75以上的MYB蛋白基因（表1）。

1.2 方法

1.2.1 茶樹兒茶素合成相關MYB轉錄因子生物信息學分析

利用在線工具ProtParam （http：//web.expasy. org/protparam）對其進行理化性質分析，并用PSIPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred）在線數據庫分析其二級結構。通過SWISS- MODEL（https://www.swissmodel. expasy.org）數據庫進行MYB蛋白三維結構的同源建模預測，登錄SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP）完成MYB蛋白的信號肽分析，采用TargetP-1.1（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TargetP）和BaCello（http://gpcr.biocomp. unibo.it/bacello）在線數據庫進行亞細胞定位分析；通過NCBI served Domains 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）在線分析MYB蛋白保守結構域。

表1 基于轉錄組篩選的與兒茶素合成相關的茶樹MYB序列

注：“-”基因功能未注釋。Note: Gene function was not annotated.

表2 茶樹兒茶素合成相關MYB蛋白理化性質

1.2.2 茶樹兒茶素合成相關MYB轉錄因子同源性分析

通過NCBI數據庫的Blast工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對茶樹兒茶素合成相關的6個MYB轉錄因子氨基酸序列進行同源性比對，使用DNAMAN構建6個MYB轉錄因子的系統進化樹。

1.2.3 茶樹兒茶素合成相關MYB轉錄因子差異表達分析

參照GB/T 8318—2008茶葉中茶多酚和兒茶素含量的檢測方法，對高酯型兒茶素新品系“1005”（E）及其父本黃旦（M）、母本福云七號（F）的芽頭、二葉、四葉進行兒茶素含量檢測，并對其進行雜交優勢分析。

中親優勢=（E－雙親均值）/雙親均值í100%

超親優勢=（E－高親本值）/高親本值í100%

負向超親優勢=（E－低親本值）/低親本值í100%

利用高酯型兒茶素新品系“1005”（E）及其父本黃旦（M）、母本福云七號（F）不同發育時期的鮮葉轉錄組數據，分析6個與兒茶素合成相關的MYB基因在茶樹葉片不同發育時期的表達差異，以及在親代遺傳上的表達規律。

2 結果與分析

2.1 茶樹兒茶素合成相關MYB轉錄因子理化性質分析

采用Open Reading Frame Finder將6個MYB轉錄因子的cDNA序列翻譯成氨基酸，利用ProtParam分析MYB蛋白的理化性質，結果見表2。6個與兒茶素合成相關的MYB轉錄因子蛋白相對分子量在8~53?ku之間，其中comp150334_c1、comp130756_c0、comp109329_c0和comp159173_c0 4個為酸性蛋白（理論等電點<7），comp143073_c0和comp166178_c0為堿性蛋白（理論等電點>7）。穩定性分析發現，comp166178_c0的不穩定指數為38.36，小于40，判定其為穩定蛋白[33]，其余均為不穩定蛋白（Ⅱ>40）。平均親水指數均小于0，說明6個MYB蛋白均為親水性蛋白。

2.2茶樹兒茶素合成相關MYB轉錄因子二、三級結構預測

蛋白的生物功能除了受氨基酸序列的影響之外，其空間結構通常也可以幫助我們理解蛋白質的功能單位。利用PSIPRED在線數據庫對茶樹6個與兒茶素合成相關的MYB轉錄因子基因編碼的氨基酸序列進行二級結構的預測（圖1），發現這些基因編碼的蛋白二級結構基本都是由α-螺旋和無規則的卷曲組成，其中comp150334_c1、comp143073_c0、comp130756_c0、comp109329_c0和comp166178_c0編碼的蛋白二級結構中α-螺旋（Helix）比例分別為24.54%、11.31%、38.38%、41.49%、53.33%，無規則卷曲（Disordered）所占的比例分別為75.46%、83.74%、61.62%、58.11%、46.67%，在comp143073_c0編碼的蛋白中發現有4.95%的β-折疊（Sheet）。在comp159173_c0中僅發現3個構成α-螺旋的氨基酸殘基，7個構成β-折疊的氨基酸殘基，其余均為無規則的卷曲，占到氨基酸總量的91.53%。登錄swiss-model數據庫，對6個基因編碼的氨基酸序列進行同源建模預測分析，預測得到的蛋白3D模型如圖2，其構象與蛋白的理化性質和二級結構預測結果一致。

圖1 茶樹兒茶素合成相關MYB蛋白二級結構

圖2 茶樹兒茶素合成相關MYB蛋白空間構象

2.3茶樹兒茶素合成相關MYB轉錄因子信號肽與亞細胞定位分析

信號肽是指位于分泌蛋白N端的一段由15~30個氨基酸殘基組成的疏水性短肽鏈，其功能主要是引導蛋白質多肽鏈完成跨膜轉移。通過信號肽的分析不僅可以判斷一個蛋白質是否為分泌蛋白，還能推測一個蛋白質或新生肽鏈的細胞定位。利用SignalP 4.1 Server數據庫分析本研究涉及的6條蛋白質序列，按照默認的神經網絡模型和隱馬爾可夫模型進行信號肽分析，結果顯示全部6條序列均不存在信號肽，屬于非分泌蛋白，即6個MYB蛋白均在細胞內完成相關生物功能。

為進一步研究這些蛋白在細胞內的分布，采用TargetP在線數據庫對6條氨基酸序列進行亞細胞定位分析，結果顯示comp143073_c0和comp159173_c0編碼的蛋白定位在葉綠體的概率為0.64和0.765，其余4個基因定位在其他細胞器（表3）。采用BaCello進一步進行定位分析，結果顯示這4個基因編碼的蛋白質均定位在細胞核上。信號肽預測和亞細胞定位分析的結果均排除了這6個基因編碼的蛋白為分泌蛋白，在細胞外發揮作用的可能，預測其在細胞內完成相關生物學功能。

表3 茶樹兒茶素合成相關MYB蛋白亞細胞定位

注：置信度分類從1到5，1表示最高的預測可靠度，difference>0.8; 2: 0.8>difference>0.6; 3:0.6>difference>0.4; 4: 0.4>difference>0.2; 5: 0.2>difference。定位：C葉綠體；M線粒體；_其他任何位置；*未知位置。

Note: Confidence level ranged from 1 to 5, and 1 shows the highest predicted reliability, difference>0.8. 2: 0.8>difference>0.6. 3:0.6>difference>0.4. 4: 0.4>difference>0.2. 5: 0.2>difference. Location: C, Chloroplast. M, Mitochondria. _, Other location.*, Unknown location

2.4茶樹兒茶素合成相關MYB轉錄因子保守基序分析

利用NCBI 序列分析工具Open Reading Frame Finder分析6條MYB基因的蛋白序列，將翻譯出的蛋白序列進行BLASTP同源比對，對MYB蛋白進行保守基序的分析（圖3）。結果顯示在comp150334_c1、comp143073_c0、comp109329_c0和comp166178_c0均發現1~2個高度保守的SANT結構域（SWI, ADA, N-CoR and TFIIIB），說明這4個MYB轉錄因子都屬于典型的SANT家族基因。在comp150334_c1氨基酸序列的第9~125位置發現一個REB結構域，屬于MYB超家族蛋白；在comp143073_c0氨基酸序列的第106~151位置發現一個COG結構域，為組蛋白乙酰轉移酶復合物（SAGA/ADA）亞基ADA的保守結構域；在comp109329_c0氨基酸序列的第29~68位置發現一個PLN保守結構，該結構為轉錄阻遏型因子MYB5的保守結構域。另外在comp130756_c0氨基酸序列上發現兩個GT1保守結構域，分別位于第98~160和391~456位置，為MYB類轉錄因子的保守結構域，屬于SANT類超家族基因；在氨基酸序列的第241~398位置發現一個PRK結構，該結構為DNA聚合酶III的亞基保守結構域。在comp159173_c0的氨基酸序列中沒有發現任何保守基序。

2.5 茶樹兒茶素合成相關MYB轉錄因子同源性分析

將茶樹6個與兒茶素合成相關的MYB轉錄因子蛋白序列通過NCBI在線BLASTP，獲得的同源比對結果表明，comp150334_c1與白樺（，AMR97400.1）相似性70%、可可（，EOY03526.1）相似性69%；comp143073_c0與茶樹（，AJF46887.1）相似性99%、亞洲棉（，KHG05222.1）相似性78%；comp130756_c0與麻風樹（，XP_012089242.1）相似性53%、木薯（，XP_021620176.1）相似性52%；comp109329_c0與橡膠（，XP_021635948.1）相似性96%、核桃（，XP_018813014.1）相似性93%；comp159173_c0與葡萄（，XP_010651953.1）相似性56%、麻風樹（，XP_018807434.1）相似性54%；comp166178_c0與其他物種間的相似性均低于50%。由此推測茶樹兒茶素合成相關的6個MYB蛋白可能屬于不同的亞型，具有較遠的親緣關系。

為進一步探究這6個MYB蛋白的系統進化關系，利用DNAMAN軟件構建其系統發育樹（圖4），6個蛋白序列在進化發育樹上形成了4個分支，comp150334_c1和comp109329_c0聚為一類；comp143073_c0與comp159173_c0聚為一類，另外兩個蛋白各占據一個分支。結合序列相似性和保守基序的分析可以發現，聚類在一起蛋白comp150334_c1和comp109329_c0擁有大致相同的保守基序位置，在序列相似性上表現較低的兩個蛋白自成一簇，推測這兩個蛋白的基因可能來自不同的演化途徑，其親緣關系較較遠，也有可能是目前可檢索到的這兩個蛋白的同源序列背景較少。

2.6 茶樹兒茶素合成相關MYB轉錄因子差異表達分析

參照《GB/T 8318—2008茶葉中茶多酚和兒茶素含量的檢測方法》，對高酯型兒茶素新品系“1005”（E）及其父本“黃旦”（M）、母本“福云七號”（F）的芽頭、二葉、四葉進行兒茶素含量檢測，并對其進行雜交優勢分析，結果見表4。在子代“1005”的茶芽和二葉期，酯型兒茶素的含量超出四葉期2.6~3.6倍，兒茶素總量也超出四葉期1.8~2.2倍，同時兒茶素合成的雜交優勢也主要體現在茶芽和二葉期。酯型兒茶素在茶樹鮮葉發育的各個時期都表現出超高親和部分超親的優勢，而非酯型兒茶素則表現出負向超親優勢，僅在四葉期表現出部分超親優勢，兒茶素總量的雜交優勢同酯型兒茶素的變化類似。

圖3 茶樹兒茶素合成相關MYB蛋白的保守結構域

圖4 茶樹兒茶素合成相關MYB蛋白系統進化樹

表4茶樹新品系“1005”及其父母本鮮葉不同發育時期兒茶素含量與雜交優勢

Table4 Catechin contents and heterosis of ‘huangdan’, ‘fuyun 7’ and ‘1005’ tea plant in different leaf developmental stages

注：同一指標中不同小寫字母表示差異達到1%顯著水平，大寫字母表示差異達到0.5%顯著水平，“- -”和“-”分別表示負向完全優勢和負向中親優勢，“++”和“+”分別表示超親優勢和中親優勢

Note: In the same index, the different alphabet of small letters indicates difference to 1% significant level, and capital letters indicates 0.5%. The items of “--” and “-” indicate negative complete advantage and negative mid-parent heterosis, respectively. The items of “++” and “+” indicate over-parent heterosis and mid-parent heterosis, respectively.

基因決定表型是生物遺傳的規律，為了進一步探究兒茶素含量與茶樹兒茶素合成相關的6個MYB因子之間的關系，本研究利用轉錄組數據分析這6個轉錄因子在茶樹葉片不同發育時期的表達差異，用RPKM（Reads Per Kilo bases per Million mapped reads）來估算基因的表達量[34]。

差異表達的結果顯示，只有comp166178_c0基因在不同發育時期的表達量無顯著差異。進一步分析其余5個基因在子代和父母本的鮮葉不同發育時期的表達差異（圖5）發現在茶樹嫩芽中，5個MYB轉錄因子基因在子代“1005”中都表現出超高親優勢。在子代“1005”的二葉中，comp150334_c1基因表現出超高親優勢，而comp109329_c0基因表現出負向完全優勢，comp143073_c0、comp130756_c0和comp159173_c0則表現出中親優勢。在第四葉當中的表達分析發現，5個基因在母本福云七號中的表達量顯著高于在父本黃旦和子代“1005”中的表達量，comp150334_c1、comp109329_c0和comp159173_c0基因在子代中表現出負向中親優勢，comp143073_c0基因表現出中親優勢，而comp130756_c0基因則表現出負向完全優勢。

圖5 茶樹新品系“1005”及其父母本鮮葉不同發育時期MYB基因表達差異

3 討論

植物MYB轉錄因子是一類與調控植物生長發育、生理代謝、細胞形態和模式建成等生理過程相關的轉錄因子，在植物中普遍存在，同時也是植物中最大的轉錄家族之一[12]。兒茶素的生物合成是一個極為復雜的過程，受到大量關鍵酶基因的直接影響，而這些酶基因的表達又受到相應轉錄因子的調控[18]。本研究基于高通量測序和基因功能分析發現的茶樹新品系及其父母本鮮葉不同發育時期與兒茶素合成相關的MYB轉錄因子基因，利用生物信息學的方法對這些轉錄因子基因的理化特征、結構功能、進化特征和表達模式進行分析，結果發現6個MYB轉錄因子都屬于親水性的非分泌蛋白，說明其發揮生物學功能的位置可能在細胞質內，與茶樹其他MYB家族蛋白的理化性質類似[35]，其中5個轉錄因子帶有SANT保守位點。SANT結構域的存在揭示了這些MYB蛋白在調控靶標基因時可能是其中一個SANT結構域與靶DNA結合，同時另一個SANT結構域起到蛋白-蛋白相互作用的功能，或者通過SANT結構域進一步增強MYB蛋白與靶標DNA的相互作用[36]。系統進化分析的結果顯示這6個MYB蛋白可能屬于不同的亞型，推測其在功能上存在較顯著的差異，可能涉及到兒茶素代謝途徑的全過程。通過分析兒茶素含量和基因表達量之間的關系發現6個MYB轉錄因子的表達量與兒茶素在鮮葉中的合成量呈正相關，說明這6個MYB轉錄因子在兒茶素的合成中起到正向調控的作用。

在植物中還存在著MYB、bHLH和WD40 3種蛋白的復合體結構，簡稱MBW復合體。這些復合體也參與類黃酮物質的生物合成。擬南芥中的MBW復合體TT2/TT8/TTG1能夠調控種皮中原花青素的合成[37-38]。在矮牽牛中發現的 AN2/AN1/AN11復合體則通過調控花青素代謝途徑中重要的結構基因DFR和CHSJ的表達從而控制花冠中花青素的合成[39-41]。本課題組前期的工作在高酯型茶樹新品系“1005”及其父母本不同發育時期的葉片中發現了顯著差異表達的MYB和bHLH兩類轉錄因子，但是這些差異表達的基因與兒茶素含量的關聯系數卻很低，這表明它們可能對兒茶素的合成起到負調控作用或者需要與其他轉錄因子形成轉錄復合體協同調節兒茶素的合成代謝[32]。因此，繼續深入發掘MYB轉錄因子及其復合體在兒茶素合成代謝中的功能，進一步認識茶樹兒茶素代謝的合成及調控過程，為茶樹育種和改良方式提供理論依據，這些將是今后研究的重點。

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Bioinformatic Analysis of MYB Transcription Factors Involved in Catechins Biosynthesis in Tea Plant ()

ZHANG Yue, HU Yunfei, WANG Shumao, KE Zixing, LIN Jinke*

Anxi College of Tea Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

Six MYB transcription factors involved in the biosynthesis of catechins were obtained from the tea plant () transcriptome database. Bioinformatic analysis including the physicochemical properties and structural functions of proteins, nuclear localization signal (NLS), protein conserved domain (PCD) and phylogenetic tree analysis were performed. The results demonstrated that the 6 MYB proteins involved in the biosynthesis of catechins belong to hydrophilic non-secretory proteins and are predicted to be located in the chloroplasts, mitochondria and nucleus. The main spatial structures are α-helixes and β-turns. Except the comp159173_c0, the other 5 genes belong to SANT super-family group based on the PCD analysis. The phylogenetic tree analysis shows that 6 MYB proteins are classified into 4 groups, indicating a distant relationship between them. Differential gene expression analysis further confirmed the close correlation between the 6 transcription factors and the catechin biosynthesis.

catechins, MYB transcription factors, bioinformatics

S571.1；Q946.8

A

1000-369X(2018)02-162-12

2017-10-12

2017-11-03

福建省教育廳中青年教師教育科研項目（JAT170178）、福建農林大學人才引進科研啟動基金（KXR15008A）、國家自然科學基金（31170651）

張玥，女，講師，博士研究生，主要從事茶樹分子生物學研究，yaoyao86527@163.com。

ljk213@163.com