柚子皮水溶性多糖提取工藝研究

王文志

摘 要：柚皮細顆粒樣品經石油醚回流脫脂、熱水提取，以葡萄糖為參照品，利用分光光度法測定沙田柚皮中水溶性多糖的含量。

關鍵詞：柚子；水溶性多糖；提取；測定

柚子又名“文旦”，味甘酸、性寒，具有理氣化痰、潤肺清腸、補血健脾等功效，能治食少、口淡、消化不良等癥，能幫助消化、除痰止渴、理氣散結。柚子的營養價值很高，含有非常豐富的蛋白質、有機酸、維生素以及鈣、磷、鎂、鈉等人體必需的元素，還含有多種活性成分，如柚皮甙、多糖、檸檬苦素、酚酸、香精油等。

目前，對柚子的研究多針對其精油、生物黃酮的提取及其抗氧化性能的研究，而國內外有關柚子皮多糖的提取和測定的研究鮮見報道。多糖是以天然產物形式存在的，大多數是以氫鍵等方式與其他多糖或物質聚合在一起，它對腫瘤、肝炎、心血管、抗衰老等方面有獨特的生物活性，且細胞毒性極低，對柚子皮多糖的提取和性能研究頗具價值。

本實驗將沙田柚皮細顆粒經石油醚回流脫脂后，采用熱水浸泡法提取柚皮中的多糖，用濃硫酸催化水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物而與苯酚縮合成黃色化合物，利用分光光度法進行有效測定，此方法條件溫和、操作方便，可普遍應用于植物水溶性多糖的測定。

1 原料、儀器和方法

1.1原料

柚子：市售（柚皮顆粒40℃烘箱中烘干）； 葡萄糖標準液：0.6000 mg/mL；5.0%苯酚溶液；無水乙醇、石油醚（沸程 30～60℃）、丙酮、甲醇、木瓜蛋白酶、濃硫酸、氯仿等均為分析純，濃度>99%，實驗用水為去離子水。

1.2儀器

數顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市醫療儀器廠；2100-型可見光分光光度計：上海龍尼柯儀器有限公司；80-2 型低速臺式離心機：江蘇省金壇市醫療儀器廠。

1.3方法

1.3.1柚皮多糖的提取

取適量柚皮細顆粒置于圓底燒瓶中，加入石油醚，40℃回流浸提 2 h，抽濾并揮干濾渣溶劑。然后分別取定量濾渣，以水作為溶劑，采用不同的溫度、料液比、提取時間對濾渣進行多糖的提取實驗。合并濾液，濃縮至原濾液體積的1/4，加入體積相當于溶液體積3倍的95%乙醇，多糖呈絮狀沉淀析出，靜置24 h 后，離心分離（3000～6000 r/min）20min 左右。用適量無水乙醇、丙酮洗滌沉淀多次，烘干即得沙田柚皮粗多糖。

1.3.2粗多糖的純化

提取后的粗多糖中含有蛋白質、色素等雜質，利用木瓜蛋白酶法去除這些雜質，并對多糖組分進行分級，以得到多糖精品。將木瓜蛋白酶按蛋白酶∶多糖= 1∶20加入多糖溶液中，70℃下在恒溫磁力攪拌器中保溫5h，加入多糖溶液體積1/5 體積的氯仿，再加入氯仿體積1/5的正丁醇，混合后劇烈震蕩20～30 min，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質，重復3次。濃縮、醇沉、洗滌、干燥，得脫蛋白的多糖。

1.3.3多糖的測定

按照不同體積量準確移取0.6000 mg/mL的葡萄糖標準溶液分別轉移到50 mL容量瓶中定容、搖勻得系列對照品溶液。然后多次取對照溶液 2.0 mL 置于 10 mL具塞試管中，加入 4.0%苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸4.0 mL搖勻，沸水浴保溫15 min 后放入冷水中冷卻。以試劑空白為參比，選用5 mm比色皿在最大吸收波長490 nm處測定其吸光度，得標準曲線，并根據標準曲線計算出每次實驗總糖含量。

2 實驗分析

2.1最佳波長的選擇

分別吸取一定量的葡萄糖標準溶液和樣品溶液，進行波長掃描實驗。結果發現，波長在490nm附近吸收最大，故選擇λmax=490nm處為吸光度測定波長。

2.2標準曲線的制作

根據上述選定的最佳實驗條件繪制標準曲線圖。總糖量（x）在15 ～ 100.0 μg/mL范圍內與吸光度（A）呈良好的線性關系。用最小二乘法進行回歸，得標準曲線方程為：A = 0.00755x+0.07475，線性相關系數R=0.9992。

2.3提取工藝條件優化

2.3.1時間對多糖提取率的影響

隨加熱時間增長，多糖逐步溶解，但時間過長多糖又要分解，實驗得知最佳提取時間為3h。

2.3.2溫度對多糖提取率的影響

在不同溫度下，測定多糖提取率，實驗表明：溫度越高，多糖的提取率越高，但高溫長時間熱水浸泡回流提取會對多糖的結構和生理活性有一定的影響，因此宜選擇90℃來提取多糖。

2.3.3料液比對多糖提取率的影響

考察料液比為1：20、1：30、1：40多糖的提取率，隨著料液比的增加，多糖提取率也增加。由于提取液在后續工序中需經濃縮，若初期加水量過大會使后續工序能耗增加，效率降低，因此宜選取料液比為1：20。

2.3.4穩定性實驗

用一定量的葡萄糖標準液按照實驗方法測定吸光度，周期是30min/次，連續3h考查其穩定性。結果表明顯色反應結束冷卻至室溫（高于20℃）時，吸光度A在3 h內保持穩定，其相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.59%。

2.3.5標準對照品的回收率和精密度

平行配制5個葡萄糖標準樣品。按照前述方法測定其吸光度、計算回收率和精密度見表2。回收率為99.00±1.15%，相對標準偏差是0.594%。

2.3.6多糖含量測定

分別稱取不同質量的干燥柚皮細顆粒和果肉，按照上述優化條件操作提取和純化，再按前面步驟進行測定，并依據標準曲線計算出水溶性多糖含量。經過三次測定的結果說明，柚皮多糖的平均產率是7.28%，相對平均偏差是0.82%；柚肉多糖的平均產率卻高達21.24%，相對平均偏差為0.56%。

2.3.7柚皮提取前后的微觀表征

未處理過的樣品組織細胞呈密閉狀態，表面比較粗糙但有一定的排布規則。而回流提取3 h后的樣品組織細胞已呈完全擴張狀態促使有效成分快速溶出。由于溫度和溶劑作用而使組織細胞發生劇烈形變，許多細胞壁已經完全破碎并已無法辨認，有效成分已經完全析出。

3 結論

（1）經過石油醚40℃回流浸提2h脫脂，以熱水浸泡回流，抽濾，濃縮，95%乙醇洗滌，得到呈絮狀沉淀狀的多糖。靜置，離心分離，分別用無水乙醇、丙酮洗滌沉淀多次，烘干即得柚皮粗多糖。其最佳工藝條件是：90℃熱水，對料液比為1：20的樣品浸泡回流3h。

（2）糖含量在15 ～ 100.0μg/mL范圍內與吸光度（A）呈良好的線性關系，其標準曲線方程為：A=0.00755x+0.07475，線性相關系數R=0.9992。

（3）柚皮多糖的平均產率是7.28%，相對平均偏差是0.82%；柚肉多糖的平均產率卻高達21.24%，相對平均偏差為0.56%。

（4）柚皮細胞組織的微觀表征說明，經過石油醚脫脂-熱水浸泡回流3h有助于細胞壁破碎并有利于多糖等活性成分溶出完全。本實驗為沙田柚及其皮的廣泛藥用提供了新技術。

參考文獻：

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