UPLC結合正交實驗法優選正骨洗藥最佳水煎工藝

董逸凡，吳婷婷，張 蕊，許保海*

0 引言

正骨洗藥是北京積水潭醫院六十年代中醫科主任佟闊泉主任醫師(清末御醫)的經驗方。由川芎、乳香、白芷、赤芍、秦艽、續斷、羌活、透骨草、降香、紅花、沒藥、當歸、蘇木、木瓜、川牛膝、獨活、威靈仙17味中藥粉碎過篩后分裝至濾紙袋，制成每袋20 g。具有活血消腫、散風祛濕的功效。用于跌打瘀血、筋骨諸痛、風寒濕性腰痛、關節痛等，臨床療效顯著[1]。使用時取1袋水煮或開水沖泡后洗患處，每次0.5 h，藥水涼后再熱，反復數次，用后保存，每袋可用2 d。方中川芎活血行氣，祛風止痛，為方中君藥，其有效成分阿魏酸有抗炎、鎮痛和抗氧化作用[2-4]，可劑量依賴性促進體外培養大鼠成骨細胞的增殖，顯著增加ALP的活性、OPG mRNA和OA mRNA的表達，具有骨形成促進效應[5]；羌活解表散寒，祛風除濕止痛，為方中臣藥，有效成分異歐前胡素具有鎮痛、抗炎抗菌[6]、促進大鼠成骨細胞增殖與分化的能力[7]。該藥尚未制定最佳的煎煮標準，導致患者使用時，因為煎煮方法不同致使藥液濃度不同進而影響療效的問題一直存在。因此，探究正骨洗藥最佳的煎煮方法，制定正骨洗藥的煎煮標準，使其發揮更好的療效，是一個亟待解決的重要問題。

1 材料

Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀(美國Waters公司)，RE-52C型旋轉蒸發儀(上海一科儀器有限公司)，KQ3200E型超聲儀(昆山超聲波儀器有限公司)，AG285型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。阿魏酸(批號：110773-201614)，異歐前胡素(批號：110827-201611)購于國家食品藥品檢定研究院；正骨洗藥(批號：161202)；乙腈(HPLC級，默克公司)；磷酸分析純(北京化工廠)，水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 (BEH)C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色譜柱；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)；梯度洗脫：0～2 min,15% A；4～14 min,25%～65% A；14～16 min，65% A；16～17 min，65%～15% A；17～23 min，15% A；流速0.3 mL/min，進樣量1.0 μL；檢測波長異歐前胡素254 nm，阿魏酸330 nm；柱溫30 ℃。

2.2 對照品溶液的配制 精確稱取阿魏酸、異歐前胡素對照品適量，用適量甲醇溶解，分別定容至10 mL容量瓶中，搖勻，配制成含有阿魏酸、異歐前胡素濃度為0.193 mg/mL、0.016 mg/mL的混合對照品溶液，放入冰箱4 ℃避光保存。

2.3 正交實驗設計 根據正骨洗藥自身特點和預實驗結果，采用L9(34)正交試驗法考察煎煮時間、煎煮次數、加水量對正骨洗藥中君藥和臣藥有效成分含量的影響。以正骨洗藥中阿魏酸、異歐前胡素及湯劑浸出物得率為指標，其因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素水平表

2.4 供試品溶液的制備 取正骨洗藥1袋，根據正交實驗表所列條件進行煎煮制成湯劑溶液。精密移取湯劑樣品溶液100 mL，置于旋轉蒸發儀蒸去水溶液，所得殘渣加入80%甲醇，超聲提取30 min，提取液4 000 r/min離心10 min，取上清液，80%甲醇定容至10 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.5 各指標成分含量測定

2.5.1 標準曲線繪制 精密移取含有阿魏酸和異歐前胡素的混合對照品溶液，加入甲醇逐級稀釋，制成含阿魏酸19.285 4、38.570 8、77.141 6、115.712 4、154.283 2、192.854 μg/mL和異歐前胡素1.632 8、3.265 6、6.531 2、9.796 8、13.062 4、16.328 μg/mL的系列標準品混合溶液，按實驗條件進樣1.0 μL進行測定，分別以進樣量為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸，繪制標準曲線。見表2。

表2 線性回歸方程

2.5.2 樣品測定 按色譜條件測定9組供試品中阿魏酸和異歐前胡素含量，記錄峰面積值，計算各指標成分含量。色譜圖見圖1，阿魏酸和異歐前胡素色譜峰保留時間分別為：2.486、12.281 min。正交實驗結果見表3。

圖1 正骨洗藥UPLC色譜圖

注：A.254 nm混合對照品，B.330 nm混合對照品，C.254 nm正骨洗藥，D.330 nm正骨洗藥，E.川芎陰性對照，F.羌活陰性對照；1.阿魏酸，2.異歐前胡素

2.5.3 精密度實驗 取混合對照品溶液，按色譜條件進樣，重復測定6次，計算阿魏酸、異歐前胡素峰面積的RSD(n=6)分別為0.5%、0.17%。

2.5.4 重復性實驗 分別取正骨洗藥6份，按“2.4”項下方法各制備6份供試品溶液，按色譜條件進樣，阿魏酸平均含量為1.54 mg/g，RSD為1.31%(n=6)；異歐前胡素平均含量為0.124 mg/g，RSD為0.28%(n=6)。

2.5.5 加樣回收率實驗 取已知濃度的正骨洗藥，在高、中、低每個添加水平下，平行制備樣品3份并測定，阿魏酸、異歐前胡素的平均回收率分別為95.90%、97.10%，RSD分別為1.11%、1.61%。

表3 正交實驗結果

注：k1：“1”水平所對應的實驗指標綜合評分之和；k2：“2”水平所對應的實驗指標綜合評分和；k3：“3”水平所對應的實驗指標綜合評分和；R：極差

2.5.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h進樣，結果阿魏酸、異歐前胡素峰面積的RSD值分別為0.48%、0.34%。

2.6 最佳結果分析 采用綜合加權評分法，分別將阿魏酸、異歐前胡素、浸膏得率的權重系數設為0.3、0.2、0.5，3項中最好的指標為100分，各個指標的計分標準如下：綜合評分=Y1/1.58×0.3×100+Y2/0.126×0.2×100+Y3/33.85×0.5×100。

根據表3的實驗結果，利用SPSS 17.0統計軟件進行F檢驗，見表4。從表3的極差結果看出，影響正骨洗藥湯劑質量的各因素的主次順序為C>A>B。由表4可知，因素A和C對實驗結果有顯著影響(P<0.05)，因素B對實驗結果無顯著影響(P>0.05)。經過綜合分析，正骨洗藥的最佳水煎工藝為A2B1C2，即煎煮30 min，煎煮1次，加20倍水。

表4 方差分析

2.7 最佳工藝驗證實驗 取3份正骨洗藥，在最佳煎煮工藝的條件下重復3次實驗，測得浸出物平均得率為33.04%±0.87%，湯劑中阿魏酸的質量分數為(1.54±0.02)mg/g，異歐前胡素的質量分數為(0.124±0.00)mg/g。

3 討論

中藥湯劑是中醫臨床最常用的劑型之一，湯劑的療效與其煎煮方法有直接關系。正骨洗藥為我院骨科常用藥，為方便患者沖泡或煎煮使用，制成粉碎程度適中的藥材粗粉。相比中藥傳統飲片，中藥“煮散”具有煎出率高、節省藥材、煎煮時間短等優點[8]，故正骨洗藥不適于按照傳統飲片煎煮經驗煎煮。本實驗根據正骨洗藥自身特點設計正交實驗因素水平，取君藥、臣藥有效成分和浸出物得率為考察指標，查閱相關文獻[9-11]摸索實驗條件，得到正骨洗藥最佳水煎工藝為煎煮30 min，煎煮1次，加20倍水。該煎煮方法穩定可靠，可有效控制正骨洗藥的質量。

本實驗采用UPLC同時測定了正骨洗藥2種有效成分，實驗精密度、回收率等方法學驗證各項指標均符合要求，此方法簡便快捷，穩定可行，為臨床上更合理地使用正骨洗藥提供了實驗依據。

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