馬杜拉放線菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344發酵產物的分離鑒定與活性分析

余 成，劉 寧，張志敏，黃 英，岳昌武*

（1.遵義醫學院第三附屬醫院中心實驗室 遵義醫學院貴州省微生物資源及藥物開發特色重點實驗室，貴州 遵義 563003；2.中國科學院微生物研究所 微生物資源前期開發國家重點實驗室，北京 100020；3.遵義醫學院 醫學遺傳學教研室，貴州 遵義 563003）

迄今為止，已知得到實際應用的微生物活性物質中超過一半成來自放線菌[1]，而目前從放線菌中發現的次級代謝產物數量不足其實際存在的10%[2]。因此，對放線菌產生的次級代謝產物進行挖掘是發現創新藥物的重要途徑。由于生境（如海拔、緯度、濕度等）均對放線菌的生長代謝甚至進化都有巨大的影響[11]，所以在特殊生境下分離得到的特殊放線菌，從中獲得新的生物活性物質的可能性也更高[3]。

馬杜拉放線菌（Actinomadura sp.）是一種稀有放線菌，可產生四大家族的有高抗腫瘤活性的抗生素，分別為veractamycins、FR-900405同類物、esperamicins及barminomycins[4]。甄永蘇等[5]對一株馬杜拉放線菌進行了研究并發現了其發酵產物洋紅霉素（carminomycin），其作為抗腫癌化療藥物曾應用于臨床多年[6]。而與之結構近似的蒽環類抗生素柔紅霉素（daunorubicin）仍是臨床一線化療藥物，其在市場上供不應求，國內外一直在對采用生物發酵法制備柔紅霉素的技術進行研究[7-8]。

江西紅壤為一種富含鐵、鋁的酸性土壤，由于其特殊的生境條件，其中生長著許多特殊的放線菌[9]。本課題組從江西武山的紅壤中分離得到了一株馬杜拉放線菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344。采用改良培養基，對這株馬杜拉放線菌發酵培養后，將代謝產物分離純化，并采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）制備化合物純品，通過對其進行核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）分析和超高效液相色譜-串聯質譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）儀檢測，并將數據與相關文獻比對，鑒定菌株的次級代謝產物的結構。對純化物的抗菌活性和最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）檢測，以期為抗生素開發提供潛在的先導化合物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 測試菌株

馬杜拉放線菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344：分離自江西武山取樣點10～20 cm深的酸性紅壤；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）：濰坊醫學院；多重耐藥鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）：北京307醫院[16]；藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、綠色木霉菌（Trichoderma viride）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）：中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養基

發酵培養基：土豆淀粉10 g，葡萄糖10 g，甘油10 g，玉米漿2.5 g，蛋白胨5 g，酵母提取物2 g，人工海鹽1 g，碳酸鈣3 g，加雙蒸水定容至1 L。

菌株活化培養基采用葡萄糖酵母提取物麥芽提取物（glucose yeast extract malt extract，GYM）固體培養基：葡萄糖4 g，碳酸鈣2 g，麥芽抽提物10 g，酵母抽提物4 g，瓊脂粉18 g，加雙蒸水定容至1 L。

細菌采用LB營養瓊脂、LB肉湯培養基：北京奧博星生物技術有限公司；真菌采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，雙蒸水1 L。

1.1.3 化學試劑

乙醇、甲醇、氯仿、甲醇、乙腈（均為分析純）：北京化工廠；甲醇、乙腈、甲酸等（均為色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

硅膠60薄層層析鋁箔板：德國默克公司；柱層層析硅膠（200～300目）：青島海洋化工廠；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱：美國GEHealthcare公司；MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋：日本三洋株式會社；SPX-250B-Z培養箱：上海博訊實業有限公司；Himac CF15RX高速離心機：日本日立公司；ZQZY-CF振蕩培養箱：上海知楚儀器有限公司；LC-20A高效液相色譜儀：日本島津有限公司；G2-QTof超高效液相色譜四級桿飛行質譜聯用儀：美國沃特世有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株發酵及產物粗提

種子培養：采用劃線法將菌種活化接種于90 mm規格GYM固體培養基平皿中，28℃恒溫培養4～5 d使得氣生菌絲和孢子絲發育完善[15]。將活化菌株接種至發酵用改良VER培養基的固體培養基平皿，28℃靜置培養5 d，以獲得馬杜拉放線菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344的種子菌。將培養皿的帶菌瓊脂塊切割為1 cm×1 cm厚度為0.5 cm大小的種子塊。

發酵培養：使用30個500 mL錐形瓶（每瓶含有100 mL改良VER液體培養基，共計3 L）進行液體發酵，每瓶接種約0.5 cm3GYM固體含菌瓊脂塊，28℃條件下160 r/min振蕩培養8 d后取出。

發酵產物粗提：將培養完成后的發酵液在8 000 r/min條件下離心10min分離上清液和菌絲體。將菌絲體收集后，使用等體積無水乙醇振蕩抽提3次，每次抽提約8 h；合并乙醇抽提液后減壓濃縮并用少量甲醇溶解，減壓濃縮得菌絲體粗提物（約12 g）。

1.3.2 粗提物的HPLC分析檢測

取菌絲體粗提物50μg，溶解于400μL的甲醇中，離心取上清，取20μL進行HPLC分析其組成成分，從中選擇響應值高且分離度較好的峰，作為目標化合物。其色譜條件為：Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），柱溫28℃；流速1.0 mL/min；甲醇與水梯度洗脫（起始為20%甲醇+80%水；0～15 min甲醇體積分數由20%梯度遞增至100%；15～20 min保持100%甲醇；20 min至26.5 min維持20%甲醇+80%水不變）。

1.3.3 粗提物的硅膠柱層析

用硅膠柱層析法對粗提物進行分離[13]。采用干法上樣，流動相條件使用氯仿甲醇梯度洗脫，以氯仿∶甲醇（95∶5，V/V）比例起始，每100 mL流動相增加5%的甲醇比例，遞增至60∶40（V/V）截止。接柱時以每10 mL為一個流分，共收集90個流分。

用薄層層析法（thin layer chromatography，TLC）將流分分段。在薄層層析硅膠板上對90個流分的偶數號樣品點樣分析，在紫外燈下觀察其熒光[18]。其熒光相同的樣品點判定為含有相同組分，將相同組分的樣品合并。HPLC對合并后的樣品段進行檢測，觀察各分段的組分情況，選擇目標產物較多、樣品量較多、組分相對簡單且包含所有目標峰的分段，作為后續純化的樣品。

1.3.4 粗提物的凝膠柱層析

用LH-20葡聚糖凝膠柱對菌絲體粗提物硅膠層析柱各個濃縮后的合并流分進行分子篩：流分濃縮并濕法上樣后采用甲醇∶氯仿1∶1（V/V）混合溶劑作為流動相，等度洗脫，按照每管3 mL收集洗脫液，用1.3.3中的方法，用TLC檢測合并分段，用HPLC檢測選擇下一步的樣品段。

1.3.5 目的產物的HPLC制備與鑒定

將LH-20葡聚糖凝膠柱分離后得到的樣品段進行HPLC制備，其色譜條件為：Waters XBridge C18色譜柱（5μm，4.6 mm×150 mm），柱溫維持28 ℃；甲醇∶水88∶12（V/V）等度洗脫。采用超高效液相色譜-串聯質譜和核磁對得到的目標化合物進行結構鑒定。

1.3.6 化合物的抗菌活性測試

配制質量濃度為50μg/mL目標化合物的甲醇溶液，采用濾紙片法對目標化合物進行抗菌活性測試[14]。測試菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、鮑曼不動桿菌、綠色木霉菌、尖孢鐮刀菌。具體測試方法如下：細菌采用LB固體平皿37℃過夜培養，以質量濃度為50μg/mL目標化合物的甲醇溶液為實驗組，以100 mg/mL的廣譜抗菌藥物安普霉素的甲醇溶液為陽性對照，以純甲醇為陰性對照，在每片濾紙片（直徑為6 mm）上滴加10μL樣品，貼在涂布有1 mL約（106～107）個/mL濃度測試菌菌懸液的固體培養基平皿上培養，細菌采用LB培養基37℃培養8～12 h；真菌采用PDA培養基25℃培養24～48 h，后觀察抑菌圈直徑[11]。

采用對倍稀釋法[12]測試目標化合物的最小抑菌濃度（MIC）。將目標化合物與安普霉素分別配制成質量濃度為10 mg/mL的溶液。將藤黃微球菌于LB液體培養基中，培養至透光率為40%后稀釋1 000倍待用。用LB液體培養基進行梯度稀釋，配制成濃度為105個/mL的菌懸液。在96孔板中加入100μL LB培養基作為空白對照，加入100μL上述105個/mL不加藥測試菌液作為陰性對照，并采用安普霉素作為陽性對照藥。化合物用LB液體培養基對倍稀釋成各所需濃度，分別與90μL菌懸液混勻加入96孔板，體系終體積為100μL。生長6～8 h后無菌生長的孔板內所含化合物最低濃度，即為該目標化合物對耐藥藤黃微球菌的MIC。

2 結果與分析

2.1 放線菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344的菌絲體粗提物的制備與檢測

將放線菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344的菌絲體用無水乙醇提取，得到粗提物用HPLC檢測，結果見圖1。由圖1可知，菌絲體粗提物中成分相對簡單，選擇保留時間14.5min出為目標峰A，保留時間18.5 min處為目標峰B，保留時間19.3 min處為目標峰C。

圖1 菌株FXJ1.344菌絲體粗提物的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mycelium crude extract of strain FXJ1.344

2.2 菌絲體粗提物分離與分段

菌絲體粗品用硅膠柱層析粗分后得到90個流分，偶數號樣品點板用TLC分析，部分結果見圖2。由圖2可知，26號至52號的薄層層析在兩種波長紫外線照射下的熒光，32號樣與34號樣品組分不同，44號與46號樣品不同。故將32號后至46號前（均不含）的合并為33～45段。

圖2 菌絲體粗提物部分分段在365 nm(A)和254 nm(B)的TLC熒光圖Fig.2 TLC fluorogram of part of mycelium crude extract in 365 nm(A)and 254 nm(B)

圖3 硅膠柱層析后1～13段(A)、14～32段(B)、33～45段(C)及46～90(D)段的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of 1-13(A),14-32(B),33-45(C)and 46-90(D)segments after silica gel column chromatography

采用類似分析方法，將90個流分分為四大段：1～13、14～32、33～45、46～90段。將分段合并后用HPLC檢測，結果見圖3。由圖3可知，第一段組分極少，第二段缺少目標峰B，第三段中目標峰A處雜峰很多不利于后期分離，第四段組分得到了較好的分離，目標峰齊全且樣品量大。故選擇第四段作為后續純化的樣品。

2.3 菌絲體粗提物高效液相色譜法制備

將46～90段的濃縮液為樣品，用葡聚糖凝膠柱層析法得到47個流分，經TLC和HPLC檢測分段，選取16～28段樣品為HPLC的制備樣品。將樣品段濃縮處理，用甲醇水等度洗脫制備各化合物，結果見圖4。由圖4可知，制備得到保留時間（retention time，TR）分別為TRA=2.00 min、TRB=6.20 min、TRC=8.10 min化合物A（4.0 mg）、B（3.0 mg）和C（2.0 mg），經過核磁檢測發現化合物A為混合物，化合物B和C是純化物。

2.4 結構鑒定

采用超高效液相色譜串聯質譜法對化合物B的結構進行鑒定：深綠色針狀晶體，m/z321.0764[M+H]+，分子式：C19H12O5，計算不飽和度為14；UV λmax：224 nm、316 nm、454 nm（in MeOH）：1H-NMR（CDCl3，500 MHz）：2.38（3H，s，3-Me），6.88（1H，d，J=1.0 Hz，2-H），7.02（1H，s，4-H），7.27（1H，d，J=8.5 Hz，9-H），7.59（1H，s，5-H），7.65（1H，dd，J=8.0，7.0 Hz，10-H），7.78（1H，d，J=7.5，Hz，11-H），10.24（1H，s，1-OH），11.70（1H，s，8-OH），12.05（1H，s，6-OH）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）：21.4（C3-Me），114.7（C-7a），118.3（C3），118.5（C2），119.7（C-4），119.7（C-6a），121.6（C-11），124.0（C-5），125.1（C-9），132.8（C-12a），135.0（C-11a），137.7（C-10），141.5（C-12b），142.8（C-4a），154.3（C-1），156.6（C-6），161.9（C-8），189.2（C-12），193.2（C-7）；根據天然產物數據庫檢索，以上數據與化合物6-hydroxytetrangulol[10]保持一致，推定化合物B為6-hydroxytetrangulol。

圖4 凝膠柱層析后菌絲體粗提物樣品HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of mycelium crude extract sample after gel column chromatography

采用超高效液相色譜串聯質譜法化合物C的結構鑒定：紅褐色針狀晶體，m/z305.0814[M+H]+，分子式：C19H12O4，計算不飽和度為14；UVλmax：223 nm、314 nm、428 nm（in MeOH）：1H-NMR（CDCl3，500 MHz）：2.51（3H，s，3-Me），7.17（1H，s，2-H），7.28（1H，s，4-H），7.34（1H，d，J=8.5 Hz，9-H），7.70（1H，dd，J=8.5，7.5 Hz，10-H），7.87（1H，d，J=7.5 Hz，11-H），8.16（1H，d，J=9.0，6-H），8.34（1H，d，J=8.5，5-H），11.27（1H，s，1-OH），12.26（1H，s，8-OH）；13C-NMR（CDCl3，125MHz）：21.3（C3-Me），114.7（C-7a），120.0（C3），120.2（C2），121.3（C-4），121.3（C-6），121.29C-6a），121.9（C-11），124.8（C-9），132.4（C-12a0，134.89C-11a），136.9（C-5），137.79C-10），139.1（C-4a），142.0（C-12b），155.3（C-1），161.7（C-8），187.9（C-7），189.7（C-12）；根據天然產物數據庫檢索，以上數據與化合物tetrangulol[10]保持一致，推定化合物C為tetrangulol。化合物B、C的結構式如下：

6-hydroxytetrangulol（B）：R=OH，tetrangulol（C）：R=H

2.5 純化物B、C的抗菌活性測定

采用濾紙片法對化合物6-hydroxytetrangulol和tetrangulol進行活性測試，以甲醇為陰性對照，抗菌活性測定結果見圖5。

圖5 化合物B(6-hydroxytetrangulol)和化合物C(tetrangulol)對耐藥藤黃的濾紙片法抑菌活性測試Fig.5 Antibacterial activity tests of compound B(6-hydroxytetrangulol)and compound C(tetrangulol)by filter paper method

由圖5可知，純化物B、C均對藤黃微球菌（Micrococcus luteus）有較強的抑制活性，抑菌圈直徑分別為16 mm和14 mm，而對其他測試菌均無明顯活性。

用對倍稀釋法檢測兩個化合物的對這株耐藥藤黃微球菌的最低抑菌濃度（MIC），通過肉眼觀察和酶標儀檢測，得到陽性對照安普霉素對這株菌的MIC為7.81μg/mL，純化物B（6-hydroxytetrangulol）對這株菌的MIC為3.90 μg/mL，純化物C（tetrangulol）對這株菌的MIC為15.6 μg/mL。

3 結論

Angucyclinone類抗生素一直受到廣泛而持久的關注，此類化合物也在不斷地被挖掘發現[17]。盡管化合物6-hydroxytetrangulol和tetrangulol并非首次發現，但近年來少有國內外的文獻對其抗菌活性進行研究，本實驗發現其較好的抗藤黃微球菌活性為首次報導。本研究通過分離純化方法，對江西酸性紅壤來源的馬杜拉放線菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344的發酵產物進行了純化和鑒定，在其次級代謝產物中得到了2種angucyclinone類純化物6-hydroxytetrangulol和tetrangulol。用濾紙片法和對倍稀釋法對其抗菌活性做了研究，發現這兩個化合物均有較好的抗藤黃微球菌活性，其MIC值顯示與安普霉素的抗菌活性相當甚至更佳，有潛在的成藥價值。本研究為未來微生物發酵法生產這兩種化合物進行了初步探尋，為尋找開發新抗生素提供了先導化合物。

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