葡糖酸醋桿菌JR-02產細菌纖維素發酵工藝優化

李 玨，董夢娜，吳延鴿，梁智群，陳桂光，曾 偉*

（1.廣西大學 亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點試驗室，廣西 南寧 530004；2.廣西大學 生命科學與技術學院，廣西 南寧 530004）

細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是一類由微生物發酵合成的直鏈高分子聚合物[1]。BC在化學成分和基本組成上與植物來源纖維素相同，均由D-吡喃葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵聚合而成[2]，是一種具有優良的生物兼容性和可降解性的天然聚合物[3]。不同于一般植物來源纖維素的結構成分中混有半纖維素、木質素等雜質[4]，BC因構成單一而具有更高的化學純度，纖維結構也更加規則，具有高結晶度和高強度[5]，其富含孔隙的三維網狀結構賦予其高通透性和高持水力[6]。細菌纖維素作為一種性能出眾的生物聚合物在眾多領域具備應用潛力，其應用范圍不僅涵蓋食品、造紙、紡織等傳統行業，在生物醫藥、聲學器材、光電材料等新興行業也具有廣闊的應用前景[7-8]。

雖然細菌纖維素具備優異的性能特征和廣闊的應用前景，但受制于傳統的靜態發酵模式，低效的生產效率和過高的生產成本，制約了其大規模推廣應用[9]。相對而言，采用動態發酵模式具有更高的溶氧水平和底物置換效率，可在較短的時間內利用較小的空間創造可觀的產量[10]，是實現BC規模化生產更為現實可行的途徑。然而，目前細菌纖維素的動態發酵產量仍處于較低水平，相關技術仍不成熟，因此有必要針對動態發酵條件開展優化設計。

采用響應面法對微生物發酵培養工藝進行優化可有效提高其生產效率。鞏志金等[11]利用響應面設計對銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）SKY01產鼠李糖脂的發酵培養基組分進行了優化，鼠李糖脂產量相較優化前提升14.43%。張雯等[12]利用應面法對發酵培養基進行優化，將木醋桿菌（Acetobacter xylinum）的BC產量提高42.5%。袁帥等[13]利用響應面分析法對葡糖醋桿菌G-29的發酵培養基進行優化，其BC產量最終提高1.9倍，取得了較好的優化效果。

本研究以一株適應發酵生產且BC產量較高的為漢遜氏葡糖酸醋桿菌（Gluconacetobacter hasenii）JR-02為試驗菌株，采用單因素試驗和Plackett-Burman試驗對菌株JR-02的BC產量具有顯著影響作用的試驗因素進行篩選，并利用響應面法對動態發酵工藝進一步優化，以期提高菌株JR-02規模生產發酵條件下的BC產量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

漢遜氏葡糖酸醋桿菌（Gluconacetobacter hasenii）JR-02：廣西大學生命科學與技術學院食品發酵工程實驗室保藏。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蔗糖、冰乙酸、Na2HPO4·12H2O、MgSO4·7H2O、CaCO3等均為國產分析純。

1.1.3 培養基

種子培養基：葡萄糖40 g/L，酵母膏2.5 g/L，一水合檸檬酸2 g/L，Na2HPO4·12H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH 5.0；115℃滅菌30 min后加入2%乙醇。

發酵培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨2.5 g/L，酵母膏2.5 g/L，一水合檸檬酸1.15 g/L，Na2HPO4·12H2O 2.7 g/L，pH 5.0；115℃滅菌30 min后加入2%乙醇固體培養基在發酵培養基成分基礎上添加2%瓊脂制成。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術公司；SPX-250生化培養箱：上海躍進醫療儀器廠；HVE-50高壓滅菌鍋：日本Hirayama公司；PL303精密電子天平：德國METTLER TOLEDO公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株培養與產物提取純化

挑取菌株JR-02單菌落接種于50mL種子液，180r/min、28℃預培養24～28 h，再以2%接種量接于50 mL發酵培養基中進行發酵培養。發酵條件初始設定為：裝液量50 mL/250 mL，于28℃、180 r/min的轉速搖瓶中培養7 d。

經7 d動態發酵培養，將產物與發酵液分離，用去離子水漂洗干凈，浸于0.1 mol/L的NaOH溶液中，沸水浴30 min去除菌體及雜質，去離子水漂洗至中性，90℃烘干至恒質量，稱質量。細菌纖維素產量以純化纖維素干質量與所用發酵液體積的比值計量，單位g/L。

1.3.2 最佳發酵條件確定

在單因素試驗基礎上，利用Design Expert 8.0.6軟件分別設計Plackett-Burman和Box-Behnken試驗，篩選搖瓶動態培養條件下對菌株JR-02的細菌纖維素產量有顯著影響的因素作為自變量，并通過響應面分析各因素的主效應和相互效應關系，確定菌株JR-02生產細菌纖維素的動態發酵的最佳條件組合并進行試驗驗證。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同碳源和最適碳源質量濃度對菌株JR-02細菌纖維素產量的影響

碳源既是重要供能底物，又是參與BC合成的基礎結構物，對最適碳源的種類和濃度開展研究，結果見圖1。由圖1A可知，當碳源的質量濃度為20 g/L時，果糖的BC產量最高（2.38 g/L），葡萄糖、甘露醇次之，而以麥芽糖、蔗糖和乳糖等二糖作為底物時，菌株JR-02的BC產量則明顯降低，說明菌株JR-02在動態培養條件下對二糖利用率較低。葡萄糖與果糖的BC產量相當，從經濟性角度出發，選定葡萄糖作為最適碳源。由圖1B可知，當葡萄糖的質量濃度達到30 g/L時取得最高BC產量（2.97 g/L）。因而，選定最適碳源葡萄糖的質量濃度為30 g/L。

圖1 不同碳源(A)和葡萄糖質量濃度(B)對菌株JR-02細菌纖維素產量的影響Fig.1 Effects of different carbon sources(A)and glucose concentration(B)on the bacterial cellulose yield of strain JR-02

2.1.2 不同氮源和最適氮源質量濃度對菌株JR-02細菌纖維素產量的影響

氮源是微生物生長代謝所需的重要營養源，培養基中添加不同的氮源種類和質量濃度對BC產量影響結果見圖2。由圖2A可知，當發酵培養基的氮源質量濃度為5g/L時，以玉米漿干粉作唯一氮源的培養基BC產量最高（2.09g/L）。且相較于酵母膏、蛋白胨等有機氮源，玉米漿干粉具有成本優勢，故選用玉米漿干粉作為最佳氮源。由圖2B可知，當玉米漿干粉的質量濃度達到15g/L時，菌株JR-02取得最高BC產量（2.46g/L）。因而，選定玉米漿干粉的最佳質量濃度為15g/L。

圖2 不同氮源(A)和玉米漿干粉質量濃度(B)對菌株JR-02細菌纖維素產量的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources(A)and corn steep powder content(B)on the bacterial cellulose yield of strain JR-02

2.1.3 乙酸和乙醇含量對菌株JR-02細菌纖維素產量的影響

圖3 乙酸(A)和乙醇(B)含量對菌株JR-02細菌纖維素產量的影響Fig.3 Effects of acetic acid(A)and ethanol(B)contents on the bacterial cellulose yield of strain JR-02

添加有機酸和乙醇作為輔助碳源對BC產量的影響結果見圖3。由圖3A可知，當以乙酸替代檸檬酸作為有機酸成分加入發酵培養基時，為取得最高BC產量，乙酸的最適質量濃度為3g/L。由圖3B可知，在發酵培養基中添加乙醇可提高動態發酵條件下BC產量，當添加15mL/L乙醇時，菌株JR-02取得最高BC產量，因此，選定乙醇的最適含量為15 mL/L。

2.1.4 無機鹽質量濃度對菌株JR-02細菌纖維素產量的影響

不同的無機鹽質量濃度對菌株JR-02 BC產量的影響結果見圖4。由圖4A可知，當Na2HPO4的質量濃度為3g/L時，菌株JR-02的BC產量最高。因此，Na2HPO4的最佳質量濃度為3g/L。由圖4B可知，當發酵培養基中MgSO4的質量濃度在0～0.10 g/L范圍內，菌株JR-02的BC產量隨MgSO4的質量濃度增加而發生顯著提升，并在MgSO4的質量濃度為0.10 g/L時BC產量最高。因此，MgSO4最佳質量濃度為0.10 g/L。由圖4C可知，隨培養基中CaCO3的質量濃度增加，菌株JR-02的BC產量也隨之升高，并在其質量濃度達到0.8 g/L時取得最高BC產量。因此，CaCO3最佳質量濃度為0.8 g/L。

圖4 Na2HPO4(A)、MgSO4(B)和CaCO3(C)質量濃度對菌株JR-02細菌纖維素產量的影響Fig.4 Effects of Na2HPO4(A),MgSO4(B)and CaCO3(C)concentrations on the bacterial cellulose yield of strain JR-02

2.1.5 發酵條件對菌株JR-02細菌纖維素產量的影響

不同的發酵條件對菌株JR-02 BC產量的影響結果見圖5。由圖5A可知，初始pH對菌株JR-02的纖維素合成能力影響較大，隨著pH值升高產量逐步升高，在pH 4～6范圍內均能取得較高產量，因而選定產量最高的pH 5.0為最適pH值。由圖5B可知，搖床轉速為160 r/min時，菌株JR-02取得最高BC產量，而隨著轉速進一步提升，BC產量卻隨之下降，可見高轉速不利于菌株JR-0合成積累細菌纖維素，因此選定160 r/min為最佳轉速。由圖5C可知，菌株JR-02合成纖維素的最適溫度范圍在28～30℃，當溫度＞30℃后，BC產量大幅下降，因此選擇30℃作為最適培養溫度。

圖5 初始pH值(A)、搖床轉速(B)和溫度(C)對菌株JR-02細菌纖維素產量的影響Fig.5 Effects of initial p H(A),shaker speed(B)and temperature(C)on the bacterial cellulose yield of strain JR-02

2.2 響應面優化發酵條件

2.2.1 Plackett-Burman試驗

根據單因素試驗結果進行Plackett-Burman（PB）試驗，以菌株JR-02的細菌纖維素產量（Y）作為響應值，設計包含葡萄糖（A）、玉米漿干粉（B）、乙酸（C）、Na2HPO4（D）、MgSO4（F）、CaCO3（G）、乙醇（H）、初始pH值（K）、培養溫度（L）、搖床轉速（M）10個因素及3個虛擬因素E、J、N的20組試驗。試驗設計與結果見表1，主效應分析結果見表2。

表1 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 1 Design and results of Plackett-Burman experiments

表2 Plackett-Burman試驗各因素主效應分析Table 2 Main effect analysis of each factor of Plackett-Burman experiments

由表2可知，PB試驗模型的P值為0.016 7＜0.05，說明模型顯著；動態發酵過程中影響菌株JR-02的BC產量的4個顯著性因素排序為pH（K）＞MgSO4（F）＞玉米漿干粉（B）＞乙醇（H）。以上4個顯著因素作為Box-Behnken試驗設計的自變量，對菌株JR-02的BC產量進一步優化。其余6個因素對菌株JR-02的BC產量影響不夠顯著，故選取單因素最佳值作為固定參數，分別為葡萄糖30g/L、乙酸3g/L、Na2HPO43 g/L、CaCO30.8 g/L、培養溫度30℃、搖床轉速160 r/min。

2.2.2 Box-Behnken試驗

根據PB試驗結果進行Box-Behnken試驗設計。以菌株JR-02的BC產量（Y）作為響應值，選取玉米漿干粉（X1）、MgSO4（X2）、乙醇（X3）和pH（X4）四個對BC產量（Y）具有顯著性影響的因素作為自變量，進行Box-Behnken試驗設計，共進行29組試驗。試驗設計與結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

續表

表4 Box-Behnken試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of Box-Behnken experiments results

由表4可知，回歸模型F值為12.84，且顯著性檢驗為極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.273 9＞0.05），說明該模型可靠。利用統計軟件Design Expert 8.0.6對表3數據進行回歸擬合，得到BC產量（Y）對自變量玉米漿干粉（X1）、MgSO4（X2）、乙醇（X3）、pH（X4）的多元回歸方程為：

回歸方程決定系數R2=0.927 7，信噪比RSN=13.718，表明回歸方程的擬合程度和可信度較高，說明該回歸方程可用于對響應值BC產量的分析預測。

2.2.3 響應面分析及最佳發酵條件的確定

圖6 各因素交互作用對菌株JR-02細菌纖維素產量影響的響應面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factor on the bacterial cellulose yield of strain JR-02

固定一個參數在零水平，探討其余兩個參數見交互作用對BC產量影響結果的響應面及等高線結果見圖6。由圖6可知，玉米漿干粉與MgSO4（X1X2）、玉米漿干粉與pH（X1X4）、乙醇與pH（X3X4）對BC產量影響的交互作用較強，玉米漿干粉與乙醇（X1X3）、MgSO4與乙醇（X2X3）、MgSO4與pH（X2X4）對BC產量影響的交互作用較弱。四個自變量因素中，玉米漿干粉（X1）、MgSO4（X2）和初始pH值（X4）對BC產量的影響顯著，響應面曲線較陡，呈現明顯變化趨勢；而乙醇（X3）對BC產量的影響相對較小，曲線則較為平緩，因素水平變化對響應值的變化影響較小。

利用Design Expert8.0.6軟件優化設計功能求出回歸模型響應值的極值點，獲得菌株JR-02的最高BC產量對應的最佳組合為玉米漿干粉15 g/L、MgSO40.11 g/L、乙醇9 mL/L、初始pH值4.5，在此條件下菌株JR-02可獲得的BC產量預測值為4.611 6 g/L。

根據軟件設計的最佳發酵條件組合進行驗證試驗，共3次平行試驗，菌株JR-02的BC產量平均值為（4.74±0.15）g/L，與預測值接近，說明回歸方程能比較真實地模擬各因素對BC產量的影響，因此使用該回歸模型優化菌株JR-02動態發酵生產條件是可行的。

3 結論

通過Plackett-Burman試驗設計，篩選出玉米漿干粉、MgSO4、乙醇和pH四個因素，確定為影響菌株JR-02動態發酵條件下細菌纖維素合成能力的關鍵影響因子。玉米漿干粉中的乳酸鹽成分可促進菌體的前期生長[14]，并且其具備較好酸堿緩沖能力，對穩定發酵過程中的環境pH具有一定效果，是一種廉價且營養豐富的理想氮源；Mg2+是二鳥苷酸環化酶的激活劑，而環二鳥苷酸是纖維素合成酶的變構激活劑[15]，培養基中添加一定量的MgSO4可有效促進產物積累；乙醇可作為輔助碳源被菌體代謝利用，且乙醇可有效抑制動態培養條件下纖維素合成菌向無纖維素合成能力菌體的自發突變[16]；而適宜的酸堿度（pH）有利于菌體的生長、代謝和產物積累。因此，PB試驗的篩選結果科學合理、準確有效。

利用軟件Design Expert8.0.6的響應面設計對菌株JR-02的動態發酵條件進行優化，建立了玉米漿干粉、MgSO4、乙醇和pH四個因素對細菌纖維素產量（干質量）的多元回歸方程模型，結合單因素試驗結果確定動態發酵條件的最佳組合為：葡萄糖30 g/L、玉米漿干粉15 g/L、Na2HPO43 g/L、MgSO40.11 g/L、CaCO30.8 g/L、乙醇9 mL/L、初始pH值4.5、30℃、160 r/min。優化后BC產量達到（4.74±0.15）g/L，為未優化前BC產量（2.53±0.03）g/L的1.87倍，實現了提高菌株JR-02動態發酵條件下的細菌纖維素合成能力的預期目標。

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