4株乳酸菌對(duì)模擬胃腸環(huán)境的耐受性及生長(zhǎng)特性研究

云月英，徐 娟，張小利

（內(nèi)蒙古科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱[1]。其大多無(wú)毒無(wú)害，可作為發(fā)酵劑廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，且在促進(jìn)人體健康方面發(fā)揮著重要作用，如調(diào)節(jié)腸道菌群[2]、降膽固醇[3]、抗腫瘤[4]、抗氧化[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]等。因此，乳酸菌常被用作益生菌篩選的候選菌群。人體胃腸道的極端環(huán)境在很大程度上會(huì)影響乳酸菌的活性，只有對(duì)低pH值和一定濃度的膽鹽環(huán)境具有耐受性的菌株，才能在人體胃腸道中存活，進(jìn)而發(fā)揮其生理功能[7-8]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)來(lái)源于自然發(fā)酵肉制品中的4株乳酸菌的耐酸性、膽鹽耐受性、模擬消化環(huán)境耐受性及在MRS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為其作為益生性肉品發(fā)酵劑開(kāi)發(fā)的候選菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸菌菌株：篩選自內(nèi)蒙古自然發(fā)酵肉制品，編號(hào)為M12、M18、M21和M23[9]。

牛膽鹽（生化試劑）：天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；胃蛋白酶（3 000 U/g）、胰蛋白酶（250 U/g）：美國(guó)Amresco公司。

MRS肉湯培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

人工模擬胃液：NaCl0.2g/100mL、胃蛋白酶0.35g/100mL，用HCl調(diào)整pH值為3.0，過(guò)濾除菌備用[10]。

人工模擬腸液：a液為重碳酸鈉1.1 g/100 mL、NaCl 0.2 g/100 mL、胰蛋白酶0.1 g/100 mL，用NaOH調(diào)整pH為8.0，過(guò)濾除菌備用。b液為牛膽鹽1.8 g/100mL，用NaOH調(diào)整pH為8.0，過(guò)濾除菌備用。將a液和b液以2∶1（V/V）混合即為人工模擬腸液[10]。

1.2 儀器與設(shè)備

PSX智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：寧波萊福科技有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；F200顯微鏡：上海長(zhǎng)方光學(xué)儀器廠；R20BC臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；YXQ-LS-30SII立式壓力滅菌器：上海東亞壓力容器制造有限公司；JA5003電子分析天平：上海超平科技儀器有限公司；UV-7504單光束-可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司；CX-AG050厭氧罐：上海川翔生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株耐酸性的測(cè)定[11]

將待測(cè)菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h，3 000 r/min、4℃離心10 min收集菌體，加入等體積滅菌生理鹽水洗滌2次，同樣條件下離心，菌體懸浮于等體積滅菌生理鹽水中制成供試菌液。供試菌液以4%（V/V）的接種量分別接入pH值為2.0、3.0、3.5的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3 h。利用菌落平板計(jì)數(shù)法分別于0 h和3 h進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，存活率計(jì)算公式如下：

式中：N0為0 h活菌數(shù)，CFU/mL；N1為3 h后的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.2 菌株膽鹽耐受性的測(cè)定[12-13]

供試菌液以4%（V/V）的接種量分別接種于含0.3g/100mL、0.5 g/100 mL、1.0 g/100 mL牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h。利用菌落平板計(jì)數(shù)法分別于0 h和24 h進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。

1.3.3 菌株人工模擬胃腸液耐受性的測(cè)定[14]

取l mL供試菌液接入9 mL無(wú)菌的人工模擬胃液中，混勻后，37℃、150r/min條件下培養(yǎng)2h。利用菌落平板計(jì)數(shù)法分別于0 h和2 h進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。然后取1 mL經(jīng)人工胃液處理后的菌液，接種于9 mL無(wú)菌的人工模擬腸液中，37℃、100 r/min培養(yǎng)10 h。利用菌落平板計(jì)數(shù)法分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.3.4 菌株生長(zhǎng)特性的研究[15-16]

菌株24 h生長(zhǎng)曲線和pH值的測(cè)定：將待測(cè)菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h，以不接種的MRS液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每2 h于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定菌液OD值，并測(cè)定其pH值。

不同溫度生長(zhǎng)情況：將待測(cè)菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，分別于10℃、20℃、30℃、40℃條件下連續(xù)培養(yǎng)24 h，以不接種的MRS液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定OD600nm值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的耐酸性

人體胃液的pH值通常為3.0左右，乳酸菌活菌體要想順利通過(guò)胃液，必須對(duì)低pH值環(huán)境具有一定的耐受性[17]。從圖1可以看出，不同菌株對(duì)酸的耐受程度不同。在pH值為3.5的環(huán)境中，4株菌的生長(zhǎng)情況良好，存活率均＞50%；當(dāng)pH值為3.0時(shí)，菌株M18的存活率迅速下降，僅為5.4%，其余菌株的存活率仍在50%以上；當(dāng)pH值降至2.0后，菌株M12和M23仍可存活，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐酸性能。

圖1 菌株的耐酸性Fig.1 Acid tolerance of strains

2.2 菌株的膽鹽耐受性

膽鹽可通過(guò)改變菌體外膜的通透性和對(duì)菌體脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的損傷等，影響乳酸菌的存活[18]。由圖2可知，不同濃度的膽鹽對(duì)待測(cè)菌株的抑制作用存在較大差異，且隨著膽鹽濃度的增加，抑制作用也隨之增強(qiáng)。在膽鹽質(zhì)量濃度為0.3 g/100 mL時(shí)，菌株M12和M23的存活率＞50%，M18的存活率為27.82%，M21的存活率為13.59%；當(dāng)膽鹽質(zhì)量濃度為0.5g/100mL時(shí)，菌株M12和M23仍有一定的耐受性，存活率分別為8.10%和5.66%；當(dāng)膽鹽質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 g/100 mL時(shí)，僅菌株M23存活，存活率為0.27%。綜上所述，菌株M12和M23具有較強(qiáng)的膽鹽耐受性能。

圖2 乳酸菌的膽鹽耐受性Fig.2 Bile salt tolerance of strains

2.3 菌株在模擬胃腸道環(huán)境中的耐受能力

乳酸菌保持較高的數(shù)量和活性通過(guò)胃腸道，是發(fā)揮生理功能的關(guān)鍵因素，除胃腸道的酸性和膽鹽環(huán)境外，還應(yīng)考慮胃蛋白酶、胰蛋白酶等對(duì)其的影響[19]。通過(guò)耐酸耐膽鹽性能的測(cè)定，選取耐受性較好的M12和M23為目標(biāo)菌株，進(jìn)一步研究其在模擬胃腸液中的生長(zhǎng)情況。如圖3所示，菌株M12和M23經(jīng)pH值為3.0的人工模擬胃液處理2 h，存活率可達(dá)到68.66%和56.72%，再經(jīng)人工模擬腸液處理10 h，活菌數(shù)仍高于104CFU/mL，對(duì)人工模擬胃腸液均顯示出較好的耐受性。

圖3 菌株M12(A)及M23(B)在模擬人工胃腸液中的生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth characteristics of strains M12(A)and M23(B)in simulated artificial gastrointestinal fluid

2.4 菌株24 h生長(zhǎng)曲線及pH值變化

發(fā)酵肉制品在制作過(guò)程中不經(jīng)過(guò)加熱處理，易受到腐敗菌及致病菌的污染。乳酸菌通過(guò)自身的生長(zhǎng)繁殖及代謝產(chǎn)生的乳酸和多種有機(jī)酸，對(duì)其他有害菌具有一定的抑制作用，從而提高產(chǎn)品的安全性和貯藏性[20]。因此，用于發(fā)酵肉制品的乳酸菌應(yīng)具有較快的增殖速度和產(chǎn)酸速度。

圖4 菌株M12和M23的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curves of strains M12 and M23

由圖4可知，菌株M12和M23生長(zhǎng)曲線的總體趨勢(shì)相似，適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，具有較強(qiáng)的增殖能力，經(jīng)歷了約2 h的延滯期，4～14 h內(nèi)菌體濃度快速增加，20 h以后各菌株的生長(zhǎng)速率減緩，24 h內(nèi)均已進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。

由圖5可知，菌株M12和M23具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，培養(yǎng)基的pH值與菌體OD600nm值變化趨勢(shì)一致。在培養(yǎng)初期培養(yǎng)基的pH值基本不變，4～14 h內(nèi)隨著菌體數(shù)目的增加，培養(yǎng)基pH值快速降低，由最初的6.2下降至4.6左右，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，待測(cè)菌株的增殖速度受到明顯抑制，pH值的下降速率減緩，趨于穩(wěn)定。

圖5 菌株M12和M23的p H值變化Fig.5 Changes of p H value of strains M12 and M23

2.5 菌株在不同溫度下的生長(zhǎng)情況

圖6 菌株M12和M23在不同溫度條件下的生長(zhǎng)情況Fig.6 Growth characteristics of strains M12 and M23 at different temperature conditions

由圖6可知，菌株M12和M23在肉制品的發(fā)酵溫度范圍內(nèi)均能較好地生長(zhǎng)，但不同溫度對(duì)其生長(zhǎng)情況存在明顯影響，在10～40℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高，菌體的OD600nm值均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，20～40℃條件下生長(zhǎng)較好，30℃時(shí)菌體濃度達(dá)到最大值。

3 結(jié)論

4株來(lái)源于肉制品的受試乳酸菌中菌株M12、M23在pH3.0和含0.3 g/100 mL膽鹽的MRS培養(yǎng)基中存活率較高，均＞50%。菌株M12和M23對(duì)人工模擬胃腸道環(huán)境同樣具有較好的耐受性，經(jīng)過(guò)人工模擬胃液處理2 h后，存活率均＞50%，經(jīng)人工模擬腸液處理10 h后仍可存活。同時(shí)，這2株菌具有較強(qiáng)的增殖及產(chǎn)酸能力，24 h內(nèi)均已進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，隨著菌體數(shù)目的增加，培養(yǎng)基pH值快速降低，在肉制品的發(fā)酵溫度范圍內(nèi)均能較好地生長(zhǎng)。因此，這2株菌可作為潛在的益生菌菌株應(yīng)用于肉制品的發(fā)酵，對(duì)其潛在的益生功能及安全性有待進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]郭興華，凌代文.乳酸細(xì)菌現(xiàn)代研究實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2013：3-9.

[2]房 曉，段榮帥，王鳳山.腸道菌群調(diào)節(jié)制劑的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生化藥物雜志，2014，34（1）：142-144，146.

[3]蒲 博，張馳翔，王 周，等.乳酸菌降膽固醇作用及其機(jī)理的研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造，2014，33（7）：5-9.

[4]袁起偉，郝鳳奇，楊文濤，等.乳酸菌抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2011，32（9）：303-306.

[5]彭新顏，于海洋，李 杰，等.乳酸菌抗氧化作用研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2012，33（23）：370-374.

[6]顧瑞霞.乳酸菌與免疫調(diào)節(jié)作用[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2008（6）：251-256.

[7]胡愛(ài)華，敖曉琳，陳 岑，等.乳酸菌耐酸耐膽鹽機(jī)制的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2015，36（8）：380-383，389.

[8]FEDERICIA S,CIARROCCHIB F,RAFFAELLA C,et al.Identification and functional traitsof lactic acid bacteriaisolated from Ciauscolo salami produced in central Italy[J].Meat Sci,2014,98(4)：575-584.

[9]云月英，許 銘，王文龍，等.自然發(fā)酵肉制品中乳酸菌的篩選[J].肉類研究，2017，31（6）：19-23.

[10]王立平，徐 杰，云月英，等.蒙古國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶（Koumiss）中乳桿菌潛在益生特性的研究[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2005（4）：4-10.

[11]隋 夢(mèng)，于立娟，謝遠(yuǎn)紅，等.植物乳桿菌Zhang-LL耐胃腸道逆環(huán)境及降膽固醇特性研究[J].食品工業(yè)科技，2016，37（16）：226-229.

[12]LEITEA M,MIGUEL M A,PEIXOTORS,et al.Probiotic potential of selected lactic acid bacteria strains isolated from Brazilian kefir grains[J].J Dairy Sci,2015,98(6)：3622-3632.

[13]溫子輝，李大鵬，張文天，等.降膽固醇能力強(qiáng)的耐酸耐膽鹽乳酸菌的篩選及鑒定[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，26（6）：42-44，48.

[14]李 昵.降膽固醇乳酸菌的篩選及其降解機(jī)理研究[D].廈門：集美大學(xué)，2012.

[15]王夫杰，魯 緋，渠 巖，等.3株風(fēng)味乳酸菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酸特性的研究[J].中國(guó)釀造，2010，29（9）：58-61.

[16]段 艷，靳 燁，靳志敏，等.分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)肉腸乳酸菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸能力研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（10）：206-211.

[17]張玉龍，胡 萍，王曉宇，等.侗族酸肉中抗氧化乳酸菌的耐受性及功能特性[J].生物加工過(guò)程，2016，14（6）：35-40.

[18]MERRITT M E,DONALDSON J R.Effect of bile salts on the DNA and membraneintegrity of enteric bacteria[J].J Med Microbiol,2009,58(12)：1533-1541.

[19]辛 羚，郭本恒，吳正鈞.3株乳桿菌在模擬消化環(huán)境中存活性能的研究[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2005（5）：15-17.

[20]張春暉.發(fā)酵肉制品加工技術(shù)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2014：37-40.