釀酒高粱籽粒微觀形態分析及其果皮厚度和單寧含量的相關性

閆松顯，袁 河，雷元春，趙 亮，羅汝葉，倪德讓，王 莉*

（1.貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 仁懷 564501；2.茅臺集團博士后科研工作站，貴州 仁懷 564501）

高粱（Sorghum bicolor（L.）Moench）是我國第五位禾本科栽培作物，可以作為糧食、飼料或者釀造原料來使用，具有耐貧瘠、抗逆性好的特點。近年來隨著農業生產條件的改善和新品種的推廣應用，高粱的品質指標及專用化水平均得到了極大地提升[1]。釀酒高粱作為中國白酒釀造的主要原料，需求量也越來越大[2]。

高粱穎果果皮由外果皮、中果皮和內果皮三層構成。外果皮在發育過程中細胞排列緊實，一般不含淀粉粒；中果皮細胞則排列松散，且不規則，有的品種該果皮層含有淀粉粒；內果皮層主要由管細胞與橫細胞構成。種皮層位于果皮層內側，與糊粉層緊密相連[3]，該層組織由兩部分組成：有色種皮層（有的高粱品種沒有該層）和無色種皮層[4-5]，且有色種皮層往往較厚。

果皮和種皮厚度是高粱籽粒加工制粉的一個重要參數，果皮薄的籽粒人工去皮較難，適合于機械加工[4]。不同高粱品種果皮厚度差異較大，從8～160μm不等[4]，其中中果皮層對果皮厚度的影響較大。高粱籽粒單寧主要存在于果皮和種皮中，果皮厚度、種子顏色和種皮的有無是影響單寧含量的重要因素[5-6]。研究表明單寧含量和果皮層厚度具有較強的相關關系（R＞0.64）[7]，果皮厚度＞60μm的高粱品種材料的單寧含量較高[7]。因此果皮和種皮越厚，種子顏色越紅，籽粒的單寧含量就越高。

胚乳中的淀粉粒根據成熟過程中物理狀態的不同可分為角質淀粉粒和粉質淀粉粒兩種。角質淀粉粒也稱玻璃質淀粉粒，是指種子在成熟脫水過程中高聚合態蛋白質僅僅依附在淀粉粒周圍形成的一種致密狀結構，此時的淀粉粒形態極不規則；粉質淀粉粒的間隙則較大，淀粉粒總體上呈橢圓狀形態。早期研究根據胚乳中角質淀粉占比的多少制定了明確的角質率（玻璃質率）分級[8]。谷物籽粒淀粉粒體積和表面積均呈多峰分布的特點，且個體差異較大[9]。不同的胚乳質地（直鏈淀粉和支鏈淀粉含量，角質淀粉與粉質淀粉的比例）是影響高粱籽粒加工和凝膠特性的重要因素[10]。

目前我國高粱絕大部分用于白酒釀造[11]，高粱品質的優劣直接決定了酒體的質量[12-13]。隨著釀酒行業的深度調整，酒企對高粱原料的品質和專用化水平要求越來越高。關于高粱籽粒性狀的報道有很多[3-5]，但主要集中在對淀粉粒的特性及穎果發育過程的分析，而釀酒高粱果皮和淀粉粒徑及其與品質性狀間關系的研究則較少。釀酒高粱籽粒微觀形態差異分析是研究其品質特點的一個重要途徑，該研究通過對全國已推廣主要釀酒高粱品種的果皮和淀粉粒徑長度進行分析，初步總結單寧含量和果皮厚度（果皮層和種皮層）間的關系，以期為后續釀酒高粱品質指標研究以及酒企釀造原料標準的建立提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗共采用19份在全國已推廣種植的高粱品種（主要為釀酒高粱）進行研究：紅纓子（糯性）、紅珍珠（糯性）、黔高7號（黔7：糯性）、黔高8號（黔8：糯性）、瀘州紅1號（瀘州1：糯性）、國窖紅1號（國窖1：糯性）、晉雜22號（晉22：粳性）、晉雜23號（晉23：半糯性）、晉雜35號（晉35：粳性）、晉雜103號（晉103：粳性）、晉雜104號（晉104：粳性）、晉糯3號（晉3：糯性）、晉糯202號（晉202：糯性）、兩糯一號（兩糯一：糯性）、遼粘3號（遼3：糯性）、遼雜15號（遼15：粳性）、遼雜18號（遼18：粳性）、遼雜19號（遼19：粳性）和遼雜37號（遼37：粳性）。另有一個澳洲粳高粱材料（澳洲粳）和一個西南糯高粱材料（西南糯）作為對照。

戊二醛、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）、鋨酸、二甲基甲酰胺、檸檬酸鐵銨溶液、氨溶液：國藥集團化學試劑有限公司；單寧酸（均為分析純）：德國默克公司。

1.2 儀器與設備

JSM-6390LV掃描電鏡：日本JEOL公司；Cary 6000i分光光度計：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 田間種植

所有材料于2016年4月中旬在溫室進行漂盤育苗，2016年5月初移栽至仁懷市有機高粱基地試驗田，采用隨機區組實驗，每個材料設置3次重復，每個重復為一行，其中行長3 m，行距50 cm，株距30 cm。待高粱材料開花后進行套袋隔離，2016年8月中旬后按材料成熟先后分別收獲，種子脫粒并自然曬干后留存備用。

1.3.2 檢測方法

掃描電鏡：高粱籽粒用液氮冷凍后破碎，用2.5%的戊二醛4℃固定，0.2 mol/L PBS沖洗3次，每次10 min。再用1%鋨酸4℃固定2 h，PBS沖洗3次，每次10 min。分別用體積分數為30%、50%、70%、90%、100%的乙醇溶液脫水，每個濃度批次10 min；其中體積分數100%乙醇脫水再重復一次。樣品在臨界點干燥后噴金并用掃描電鏡在15 kV電壓下進行拍照觀察。每個高粱樣品采用不同籽粒進行掃描電鏡分析，重復3次。

單寧含量測定采用國標GB/T 15686—2008《高粱單寧含量的測定方法》，每個高粱樣品重復進行3次單寧含量測定，最后計算平均含量。

高粱果皮、種皮厚度以及胚乳中淀粉粒的長度和寬度用卡尺進行測量。文中高粱籽粒的果皮厚度統指籽粒的果皮和種皮厚度之和。

1.3.3 數據分析

果皮厚度及淀粉粒長度差異的非參數Kruskal-Wallis檢驗、Wilcoxon Rank Sum檢驗、Behrens-Fisher檢驗和單寧含量與種皮厚度間的簡單線性回歸分析都在R軟件中進行分析。

2 結果與分析

不同釀酒高粱品種在植株高矮、胚乳質地及品質性狀等方面具有較大的差異[14-15]，為了說明高粱籽粒胚乳微觀形態與品質性狀間的相關關系，實驗檢測了高粱籽粒胚乳中角質淀粉粒、粉質淀粉粒及種皮厚度等微觀結構，結果見圖1。由圖1可知，高粱籽粒胚乳中角質淀粉粒（圖1A）排列緊密，形態極不規則；而粉質淀粉粒呈卵圓形（圖1B），排列松散。果皮層的外、中、內三層清晰可見（圖1C和圖1D），種皮層則緊鄰糊粉層（糊粉粒呈圓錐狀結構）。

圖1 高粱籽粒胚乳淀粉粒形態及果皮厚度Fig.1 Morphology of sorghum endosperm starch grains and pericarp thickness

不同釀酒高粱的果皮厚度、角質淀粉粒徑長、粉質淀粉粒徑長及單寧含量等指標的檢測結果見表1。

表1 不同釀酒高粱4個指標檢測結果Table 1 Determination results of four indicators of different liquor-making sorghums

2.1 果皮厚度

2.1.1 紅纓子高粱果皮厚度

以紅纓子高粱品種為例將釀酒高粱果皮厚度值的分布進行一個簡單說明，結果見圖2。

由圖2A可知，紅纓子高粱果皮厚度的分布并不集中，其中＞100μm的統計值尤為突出（圖2A右圖），這與EARP CF等[4]的研究結果相一致。頻數分布圖（圖2A左圖）表明，紅纓子高粱的果皮厚度也不是單峰分布。由于本實驗中釀酒高粱品種果皮厚度統計值主要集中在100μm以內，因此該研究只針對＜100μm的果皮厚度進行統計和分析，而果皮厚度＞100μm的則另行進行分析和研究。紅纓子高粱的果皮厚度＜100μm頻率分布見圖2B。由圖2B可知，紅纓子果皮厚度分布的概率密度曲線（圖2B左圖中細線）與標準正態分布曲線（圖2B左圖中粗線）基本吻合，說明果皮厚度在該區間的分布比較集中，呈中間多、兩頭少特點，統計異常值也較少（圖2B右圖）。紅纓子高粱的果皮厚度平均為（59.74±9.87）μm。

圖2 紅纓子高粱果皮厚度分布頻數(A)及概率密度(B)Fig.2 Distribution frequency(A)and probability density(B)of pericarp thickness of Hongyingzisorghums

2.1.2 釀酒高粱的果皮厚度差異顯著性分析

釀酒高粱品種中兩糯一的果皮厚度值最大（見表1）為83.69μm，而遼15的果皮厚度較小，為26.69μm。所有品種（材料）果皮厚度箱線圖如圖3所示，其中箱型寬度代表了樣本容量，箱型越寬表示樣本容量越大。

圖3 不同高粱品種果皮厚度對比Fig.3 Comparison of pericarp thickness of different sorghums varieties

由圖3可知，紅纓子、紅珍珠、西南糯和國窖1等品種材料的果皮厚度分布比較集中，并且種皮厚度處于中偏厚水平，而一些粳高粱品種如晉202、遼15、遼18和澳洲粳的種皮厚度則較低。

非參數Kruskal-Wallis檢驗結果表明，不同高粱品種（材料）果皮厚度差異極顯著（P＜0.01）。兩兩比較Wilcoxon Rank Sum檢驗結果表明西南糯高粱群體（紅纓子、紅珍珠、黔8、瀘州1等）分別與晉糯系列品種和東北地區的遼雜系列品種差異顯著（P＜0.05）。其中遵義地區推廣面積最大的紅纓子高粱品種與晉23、晉202、兩糯一、遼3、遼15、遼18、遼19、遼37和澳洲粳等高粱品種材料的果皮厚度差異都顯著（P＜0.05）。而兩糯一、晉202和遼15與其他大部分品種材料的果皮厚度差異也顯著（P＜0.05）。

紅纓子高粱品種的果皮（果皮層和種皮層）厚度分布不是呈單峰分布特點，但在＜100μm的范圍糯高粱品種材料的果皮厚度則比較接近，且比粳高粱品種材料果皮厚。實際生產上西南糯高粱籽粒常呈紅色，種皮層較厚，該地區粒用高粱主要作為醬香型白酒釀造原料來使用，在七個輪次制酒生產中表現出耐蒸煮和耐翻糙等特點，究其原因，籽粒具有較厚的果皮層和較小的體積。

紅纓子、紅珍珠、黔8等西南區推廣面積較大的高粱品種與晉糯系列品種和遼雜系列品種果皮厚度差異較大，其中紅纓子還分別與其他多個高粱品種果皮厚度差異明顯。該結果再次驗證了西南區糯高粱品種材料是一個獨特的種質群體，該種質群體具有籽小色紅、果皮厚、環境適應性廣等特點這一結論[1]。兩糯一高粱品種的果皮厚度值最大，晉202和遼15等高粱品種的果皮厚度值則較小，推廣面積較大的紅纓子、國窖1、晉22、遼雜系列高粱的果皮厚度則居中，說明就釀酒原料生產而言，并不僅要考慮單一品質性狀的突出，往往還要綜合考慮其他性狀表現。

2.2 角質和粉質淀粉粒徑

圖4 粉質淀粉和角質淀粉粒徑對比Fig.4 Comparison of grain diameter between corneous starch and floury starch

由圖4可知，高粱籽粒胚乳中角質淀粉粒徑長度平均為17.61μm，粉質淀粉粒徑長度平均為15.51μm，二者差異極顯著（P＜0.01）。為了便于對比分析，采用淀粉粒徑長度這一指標來對釀酒高粱胚乳角質淀粉粒和粉質淀粉粒進行比較，數據均值如表1所示。

不同高粱品種（材料）角質淀粉粒和粉質淀粉粒徑長度箱線見圖5，箱型寬度代表了樣本容量，箱型越寬表示樣本容量越大。

圖5 不同高粱品種角質(A)及粉質(B)淀粉粒徑對比Fig.5 Comparison of corneous(A)and floury(B)starch grain diameter among different liquor-making sorghums

由圖5A可知，遼15、晉22和澳洲粳等高粱品種材料的角質淀粉粒徑值較大，西南糯高粱品種材料（紅纓子、黔8、瀘州1）的角質淀粉粒徑值適中，而晉23、晉35等晉雜系列高粱品種的角質淀粉粒徑值則較低。由圖5B可知，紅珍珠、澳洲粳、遼15等高粱品種材料的粉質淀粉粒徑值較大，而晉103、遼37等高粱品種的粉質淀粉粒徑值則較低。

為了控制統計檢驗時的Ⅰ型錯誤率，實驗采用Behrens-Fisher檢驗來對高粱品種材料角質淀粉粒和粉質淀粉粒徑長度進行兩兩差異比較。結果表明，晉35與紅纓子、兩糯一、黔8和西南糯等西南區糯高粱品種材料的角質淀粉粒徑長度差異顯著（P＜0.05），紅珍珠與澳洲粳、晉22等粳高粱品種的角質淀粉粒徑長度差異顯著（P＜0.05）。紅珍珠同時還與國窖1、晉103、晉104、晉202、晉22、晉35、遼15、遼18、遼19、遼37、黔7、西南糯等高粱品種材料的粉質淀粉粒徑長度差異顯著（P＜0.05），遼37則分別與澳洲粳、國窖1、紅珍珠、晉104、晉22、晉3、遼15、遼18、遼19、黔7、西南糯等高粱品種材料的粉質淀粉粒徑長度差異顯著（P＜0.05）。

該研究中高粱角質淀粉和粉質淀粉粒徑長度的分布區間分別是13.82～20.05μm和10.50～20.00μm，這與申瑞玲等[10]和田曉紅等[16]的研究結果相一致。胚乳中淀粉粒徑長度差異較大，同一籽粒不同發育時期淀粉粒徑差異也較大，并且胚乳中靠近“淀粉發生中心”的淀粉粒徑較長，而遠離“淀粉發生中心”的淀粉粒徑則較短[3]；角質淀粉和粉質淀粉是胚乳質地的兩種結構，受遺傳和環境等因素的共同決定[17]，這是導致不同高粱品種兩種淀粉粒徑長差異的主要原因。遼15、晉22等粳高粱品種的角質淀粉粒徑長度較長，而西南區糯高粱品種紅纓子、黔8和瀘州1的角質淀粉粒徑長度則適中。北方粳高粱品種晉35與西南糯高粱品種材料的角質淀粉粒徑長度差異顯著（P＜0.05），紅珍珠高粱品種與晉雜系列品種和遼雜系列品種的粉質淀粉粒徑差異都顯著（P＜0.05），因此推測不同釀酒工藝對高粱原料的淀粉粒形態要求也是不同的（北方高粱原料主要用于清香和濃香型白酒的釀造，西南區糯高粱原料主要用于醬香型白酒的釀造）[11，18]。

2.3 單寧含量與果皮厚度的關系

為了說明高粱籽粒單寧含量與果皮厚度及淀粉粒徑長度間的關系，分別對單寧含量與果皮厚度、單寧含量與角質淀粉粒徑長度和單寧含量與粉質淀粉粒徑長度進行簡單線性回歸分析。結果表明，只有單寧含量與果皮厚度間具有較好的直線相關關系（R=0.501 4），回歸方程及回歸線見圖6。由圖6可知，所有樣點圍繞回歸線兩側分布，說明該回歸結果可靠，基本上能夠說明釀酒高粱籽粒單寧含量與果皮厚度（果皮層和種皮層）間的正相關關系，果皮厚度每增加1μm，籽粒的單寧含量則增高0.014 7%。

圖6 釀酒高粱籽粒單寧含量與果皮厚度的線性相關性Fig.6 Linear correlation between tannin content and the pericarp thickness of liquor-making sorghums

西南區糯高粱品種由于長期的自然馴化和人工選擇[1]，具有較高的單寧含量。北方的粳高粱品種材料籽粒體積較大，種皮顏色也不一致，單寧含量則較低。不同釀酒工藝對原料的單寧含量要求都不一致，醬香型白酒高粱原料比濃香型和清香型白酒高粱原料單寧含量都要高，其他的一些品質指標要求也不同。釀造原料的品質是白酒風味和質量的重要保證，原料產地與名優酒企區位分布具有很高的契合度，因此怎樣結合當地原料特點來服務釀酒產業，是我國專用糧發展的一個重要導向。

3 結論

本實驗對全國主要的釀酒高粱品種籽粒的微觀結構（果皮層和種皮層厚度、角質淀粉粒徑長度、粉質淀粉粒徑長度）進行了分析，并分別說明其與釀造性狀單寧含量間的相關性。不同釀酒高粱的果皮厚度、淀粉粒徑長度差異都比較明顯。以紅纓子為代表的西南區糯高粱的單寧含量相對較高，不同質地淀粉粒徑長度與其他地區釀酒高粱區分比較明顯，這些性狀表現是醬香型白酒紅糧原料的重要品質特點。

釀酒高粱的果皮層和種皮層厚度與單寧含量具有較好的相關性，籽粒的微觀形態是其品質性狀的重要反映。通過籽粒微觀形態差異分析可以研究不同地區釀酒原料的品質特點，也能為酒企原料標準的建立和細化提供一定的理論依據和參考。

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