廣東客家黃酒中乳酸菌分離鑒定與菌株特性研究

錢 敏，湯斯斯，趙文紅*，莫依燦，蘇曉莉，李 斌

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

廣東客家黃酒是黃酒的一個(gè)重要分支，已有兩千多年的歷史，黃酒中細(xì)菌的種類眾多，有研究者利用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorptiontimeof flight massspectrometry，MALDI-TOF）與指紋識(shí)別結(jié)合16SrRNA基因測(cè)序和種特異的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)鑒定出黃酒發(fā)酵中的細(xì)菌有芽孢桿菌（Bacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、明串珠菌屬（Ascococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、乳酸菌等[1]。其中，乳酸菌在黃酒發(fā)酵過程中起到了很大作用，與酵母共同發(fā)酵，對(duì)酒的口感與香氣起著決定性作用[2]，其來源主要是酒曲和黃酒在初發(fā)酵時(shí)從空氣接入[3-5]。在以往的廣東客家黃酒的微生物研究中，鮮有對(duì)乳酸菌的分離與鑒定，而乳酸菌與黃酒的發(fā)酵與品質(zhì)有著重要的聯(lián)系，因此將乳酸菌分離鑒定，進(jìn)行單獨(dú)研究有重要的意義。

近年來乳酸菌對(duì)外界的特性逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)，乳酸菌的耐藥能力、耐乙醇能力等特性在醫(yī)學(xué)與食品領(lǐng)域被廣泛利用[6]。通過研究其特性，可以篩選出適用于釀造的菌種，對(duì)酒類發(fā)酵的影響研究也起到重要的鋪墊作用[7-9]。本研究結(jié)合黃酒的發(fā)酵條件，對(duì)黃酒酒曲與發(fā)酵酒醪中乳酸菌菌株進(jìn)行分離純化，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化、分子生物學(xué)鑒定，并對(duì)其生長(zhǎng)曲線，產(chǎn)酸能力，對(duì)鹽、pH、糖及乙醇的耐受性進(jìn)行測(cè)定，以期為探究乳酸菌對(duì)黃酒發(fā)酵的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米：散裝市售；米酒（酒精度為29.5%vol）：廣東省九江雙蒸酒；紅曲、麥曲、酒藥：廣東河源紫金某酒廠；071880乳桿菌生化鑒定盒、溴甲酚紫（bromocresol purple，BCP）培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GI54DW型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；B104光學(xué)生物顯微鏡：重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；電磁pHS-3CpH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離

酒曲中乳酸菌分離：分別將1 g酒曲樣品（紅曲、麥曲、酒藥）磨成粉，溶于無菌生理鹽水中，進(jìn)行梯度稀釋。吸取0.2 mL稀釋液涂布于BCP瓊脂平板培養(yǎng)基，放入裝有厭氧產(chǎn)氣劑的產(chǎn)氣袋中，將產(chǎn)氣袋置于35℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h后，挑取單菌落進(jìn)行劃線分離，反復(fù)對(duì)每次培養(yǎng)完成后的菌落進(jìn)行簡(jiǎn)單染色并鏡檢，判斷其純度。分離出純的菌株后，劃線于MRS斜面培養(yǎng)基上，置于35℃培養(yǎng)箱擴(kuò)大培養(yǎng)48 h，進(jìn)行生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)，將初步確定為乳酸菌的菌株劃線接種于MRS斜面培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)48 h，保存于4℃冰箱中[10-11]。

酒醪中乳酸菌分離：取5 g酒醪置于無菌生理鹽水中攪拌得到樣品液，以酒曲中乳酸菌分離方法進(jìn)行純化[12-14]。

1.3.2 乳酸菌的鑒定

采用菌落形態(tài)觀察、生理生化特性試驗(yàn)以及分子生物學(xué)鑒定方法相結(jié)合[15-16]：對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色，觀察其形態(tài)；接入微型生化鑒定管進(jìn)行菌屬鑒定[17]；利用Ezup柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒進(jìn)行基因組的提取，提取后的DNA送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司廣州分公司進(jìn)行DNA測(cè)序，通過菌株序列16SrDNA序列對(duì)比分析及利用Mega6.0制作系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。

1.3.3 乳酸菌的菌株特性

（1）生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將2 McFarland濃度菌懸液按照2%（V/V）的接種比例，將菌懸液接入到24支裝有MRS液體培養(yǎng)基中的試管中，35℃條件下靜置培養(yǎng)，每隔2 h取出一支測(cè)菌液OD600nm值。以無菌MRS肉湯培養(yǎng)基作為空白實(shí)驗(yàn)組，在波長(zhǎng)600 nm條件下進(jìn)行OD600nm值測(cè)定，讓菌液的測(cè)定結(jié)果值在0.10～0.65的范圍內(nèi)，若結(jié)果值是稀釋后所得，則必須要乘以稀釋倍數(shù)才是菌液的實(shí)際OD600nm值。

（2）產(chǎn)酸能力測(cè)定

將2 McFarland的菌懸液，按1%（V/V）接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，35℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h。每隔6 h測(cè)定培養(yǎng)基pH[19-20]。

（3）pH對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)特性的影響

用1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基，使其pH分別為2、4、6、8、10、12。將2 McFarland的菌懸液，按1%（V/V）接種于上述培養(yǎng)基中，35℃厭氧條件下培養(yǎng)15～20 h后，取上述處理菌液，于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定OD600nm值[21-23]，考察pH對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)特性的影響。

（4）糖含量對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)特性的影響

參照文獻(xiàn)[24]中黃酒釀造過程中的總糖實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用葡萄糖將MRS肉湯培養(yǎng)基的糖含量調(diào)節(jié)為30～240 g/L，以30 g/L為梯度制成8個(gè)濃度液體培養(yǎng)基，將2 McFarland的菌懸液，按1%（V/V）接種于上述培養(yǎng)基中，35℃厭氧條件下培養(yǎng)15～20 h后，取上述處理菌液，于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定OD600nm值[25]，考察糖含量對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)特性的影響。

（5）乙醇含量對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)特性的影響

參照文獻(xiàn)中黃酒釀造過程中酒精度的變化數(shù)據(jù)[26]，將MRS肉湯培養(yǎng)基的酒精度調(diào)節(jié)為6%vol～30%vol，以6%為梯度制成5個(gè)濃度液體培養(yǎng)基，按1%（V/V）的接種量接種于上述培養(yǎng)基中，35℃厭氧條件下培養(yǎng)15～20h后，取上述處理菌液，分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定OD600nm值[27]，考察乙醇含量對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)特性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離鑒定

2.1.1 乳酸菌的分離與純化

經(jīng)過分離與純化，得到兩株乳酸菌A、E，菌株在BCP瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)如圖1所示，MRS瓊脂培養(yǎng)基的菌落形態(tài)如圖2所示，鏡檢結(jié)果如圖3所示。

由圖1可知，在BCP瓊脂培養(yǎng)基上，菌株A與E均可生長(zhǎng)，且都可使溴甲酚紫由紫色變?yōu)辄S色，其中菌株E更容易使溴甲酚紫變色，可初步判定兩株菌為乳酸菌。兩者單個(gè)菌落微小，皆＜0.5 mm，呈圓形，單個(gè)菌落呈現(xiàn)淡黃色，濕潤(rùn)，中央凸起，邊緣整齊，表面光滑有光澤，而菌株A菌落比E菌落稍大。

由圖2可知，在MRS瓊脂培養(yǎng)基上，菌株A與E長(zhǎng)勢(shì)很好，兩者單個(gè)菌落較在BCP培養(yǎng)基上生長(zhǎng)要大，這與MRS培養(yǎng)基里的充足營(yíng)養(yǎng)有關(guān)系，菌落大小在0.5～3.0mm之間，為圓形，單個(gè)菌落呈現(xiàn)乳白色，濕潤(rùn)，中間有凸起，邊緣整齊，表面光滑有光澤，且菌株A菌落比E菌落大。

圖1 菌株A和E在BCP瓊脂培養(yǎng)基上的菌落特征Fig.1 Colony characteristics of strain A and E on BCP agar medium

圖2 菌株A和E在MRS瓊脂培養(yǎng)基上的菌落特征Fig.2 Colony characteristics of strain A and E on MRS agar medium

圖3 菌株A和E的革蘭氏染色結(jié)果Fig.3 Results of strain A and E by Gram stain

由圖3可知，菌株A與E皆為革蘭氏陽(yáng)性菌，個(gè)體微小，桿狀直線型菌，無鞭毛，無芽孢。菌株A多以兩個(gè)菌體排列，菌株E則多為單個(gè)菌體存在，菌株A個(gè)體明顯比菌株E大。

2.1.2 乳酸菌的生化鑒定

生化鑒定反應(yīng)結(jié)果如表1所示。由表1可知，菌株A8種生化反應(yīng)結(jié)果均為陽(yáng)性，菌株E僅山梨醇反應(yīng)為陰性，參考乳桿菌生化鑒定盒使用說明可判斷菌株A與E為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）。

表1 菌株A和E的生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical identification results of strain A and E

2.1.3 乳酸菌的16SrDNA序列對(duì)比分析結(jié)果

將序列利用NCBI中的BLAST方法與GenBank中數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比較，比較得到相似性為99%～100%的16SrDNA序列，從中隨機(jī)選取100%的序列利用MEGA 6.0中的鄰接法（Neighbour-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)1 000次，樹為無樹根[28]。系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。

菌株A命名為Hakka yellow rice wine A，由圖4a可知，菌株A與植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）的相似率為100%，因此可以判斷菌株A為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

圖4 菌株A(a)和菌株E(b)系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain A(a)and strain E(b)

菌株E命名為Hakkayellow ricewine E，由圖4b可知，菌株E與戊糖乳桿菌（Lactobacilluspentosus）的相似率為100%，因此可以判斷菌株E為戊糖乳桿菌（Lactobacilluspentosus）。

2.2 乳酸菌的菌株特性

2.2.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

經(jīng)檢測(cè)，菌株A與E生長(zhǎng)48 h后的菌株生長(zhǎng)曲線如圖5所示。

圖5 菌株A和E的生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curves of strain A and E

由圖5可知，發(fā)現(xiàn)兩者的生長(zhǎng)情況幾乎相同，但菌株E的生長(zhǎng)比菌株A略微緩慢。2～6h時(shí)，菌株A和E生長(zhǎng)緩慢，該時(shí)段為延緩期；在6～16 h，OD600nm值快速上升，可知此時(shí)菌株在快速生長(zhǎng)繁殖，該時(shí)段為對(duì)數(shù)期；16～20 h時(shí)的OD600nm值上升緩慢，在20 h后幾乎無變化，進(jìn)入穩(wěn)定期[29-30]。

2.2.2 產(chǎn)酸能力檢測(cè)結(jié)果

菌株A和E在48 h內(nèi)的產(chǎn)酸能力如圖6所示。

圖6 菌株A和E的產(chǎn)酸能力與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系Fig.6 Relationship between acid-producing ability and culture time of strain A and E

由圖6可知，菌株A與E的產(chǎn)酸能力相當(dāng)，兩種菌的pH在0～6 h時(shí)幾乎無變化，在6～12 h時(shí)開始極速下降，該時(shí)段菌株處于對(duì)數(shù)期，菌株快速繁殖，故開始大量代謝酸性物質(zhì)；12～24 h時(shí)酸度呈緩慢下降趨勢(shì)，在24 h后酸度基本保持穩(wěn)定，菌株A的pH為3.8左右，菌株E pH保持在3.6左右，這與菌株處于穩(wěn)定期有一定關(guān)系。

2.2.3 pH對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)特性的影響

不同pH對(duì)菌株的生長(zhǎng)情況如圖7所示。

圖7 不同p H對(duì)菌株A和E生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effects of different pH on the growth of strain A and E

由圖7可知，兩菌株在不同酸度的影響下，其生長(zhǎng)趨勢(shì)幾乎相同，都是先隨著pH的增加而穩(wěn)步上升，達(dá)到1.9左右后保持平穩(wěn)，當(dāng)pH超過某個(gè)堿性值后，菌株的生長(zhǎng)受到抑制而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。其中，在pH為2～6區(qū)間里，菌株A與菌株E的生長(zhǎng)隨著酸度的減弱而不斷增強(qiáng)，當(dāng)pH6～8時(shí)的A菌OD600nm值最高，為1.969，當(dāng)pH超過8后，其OD600nm值為0.475，說明當(dāng)pH＞8，會(huì)嚴(yán)重阻礙菌株A的生長(zhǎng)；菌株E在pH6～10時(shí)，OD600nm值1.9左右，在pH10～12時(shí)，OD600nm值接近為1左右，說明菌株E在pH＞10后，生長(zhǎng)受到抑制。結(jié)果表明，菌株A和E的最適生長(zhǎng)pH為4～6。

2.2.4 糖含量對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)特性的影響

不同糖含量對(duì)菌株A和E的耐受力影響結(jié)果見圖8。

圖8 不同糖含量對(duì)菌株A和E生長(zhǎng)的影響Fig.8 Effects of different sugar concentrations on the growth of strain A and E

由圖8可知，A菌和E菌的OD600nm值隨著糖含量的增加呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，尤其當(dāng)糖含量＞90 g/L之后，菌株A和E OD600nm值迅速下降。因此，當(dāng)糖含量＞90 g/L，菌株A和E的生長(zhǎng)會(huì)受到一定的抑制。

2.2.5 乙醇含量對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)特性的影響

不同乙醇含量對(duì)菌株A和E的的影響，結(jié)果見圖9。

圖9 不同乙醇含量對(duì)菌株A和E生長(zhǎng)的影響Fig.9 Effects of different ethanol contents on the growth of strain A and E

由圖9可知，在乙醇含量為6%時(shí)，菌株E的OD600nm值為0.430，明顯高于菌株A；隨著乙醇含量的增加，菌株E的OD600nm值下降，當(dāng)乙醇含量為30%時(shí)，OD600nm值為0.352；菌株A的起始OD600nm值為0.328，在乙醇含量為6%～18%，其OD600nm值下降速率較菌株E大，在乙醇含量18%～30%時(shí)，保持平穩(wěn)在0.182左右，表明乙醇含量為18%時(shí)，對(duì)菌株A的抑制作用已達(dá)極限。因此，菌株A和E在乙醇含量＞6%之后，便受到抑制，并且菌株A較菌株E更為敏感。

3 結(jié)論

本研究對(duì)廣東客家黃酒酒曲與發(fā)酵酒醪中的乳酸菌進(jìn)行分離純化得到菌株A和E，對(duì)這兩株菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化、分子生物學(xué)鑒定，確定這兩株菌分別為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）和戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）。本研究還對(duì)它們的生長(zhǎng)曲線，產(chǎn)酸能力，對(duì)鹽、pH、糖及乙醇含量的耐受性進(jìn)行測(cè)定。兩菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果說明，在35℃條件下，培養(yǎng)2～6 h為菌株生長(zhǎng)的延緩期，6～16 h為對(duì)數(shù)期，20 h后完全進(jìn)入穩(wěn)定期。產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)說明兩菌株的產(chǎn)酸能力都很強(qiáng)；菌株A和E的最適生長(zhǎng)pH值為4～6；當(dāng)糖含量＞90 g/L，兩菌株的生長(zhǎng)受到抑制；菌株A和E在乙醇含量＞6%之后便受到抑制，并且菌株A較菌株E菌更為敏感。

乳酸菌是對(duì)黃酒發(fā)酵過程起重要作用的微生物，它的存在有利于黃酒風(fēng)味的形成與發(fā)酵環(huán)境的穩(wěn)定。目前對(duì)客家黃酒中乳酸菌的研究尚淺，特別是乳酸菌的種屬確定、自身的代謝等都有待進(jìn)一步探索，以期為黃酒品質(zhì)的改善提供更多的理論依據(jù)。

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