糯高粱黃酒糖化工藝優化及抗氧化活性分析

郭 睿，楊 玲*，郭旭凱，段 冰，邵 強，柳青山，王花云

（山西省農業科學院 高粱研究所，山西 晉中 030600）

黃酒又稱米酒，是我國的民族特產。黃酒酒精度低，耗糧少，集美味、營養和保健于一體。它富含多種氨基酸、蛋白質、維生素和對人體有益的礦物元素，并具有烹飪、藥用等功效[1]，符合世界低度飲料酒發展的趨勢，因而被國家列為重點扶植和發展的飲料酒之一[2]。優質原料是釀造高品質酒的基本條件。黃酒以稻米、黍米、玉米、小米等為主要原料[3]，南方黃酒主要選用糯米為原料，北方黃酒主要以黍米為原料，以高粱為主要原料釀造黃酒近年來鮮有報道。

釀造專用高粱中單寧含量達到1.0%～1.5%，發酵過程中單寧能被轉化為分子質量小的多酚類物質。以高粱為原料經過酶、曲等發酵過程，原料和輔料中的黃酮和多酚類物質很容易溶于發酵液中[4]，且在發酵過程中，各種物質發生復雜的化學與生化反應，生成種類更多的酚類[5]。研究表明，黃酒酚類物質的含量與黃酒的抗氧化能力呈正相關關系[6]，多酚含量越多，黃酒的抗氧化活性越強。高粱籽粒中含有一定量的黃酮類化合物[7]，黃酮類物質具有清除體內自由基、抑制腫瘤、調節細胞周期、調節免疫力、抗菌、消炎多種生理功能[8]。多酚類物質具有抗病毒、抑菌、抗癌、抗輻射、抗動脈硬化、預防心腦血管疾病和中風等多種生理功能[9]，且有延長產品保質期的作用，在食品、醫藥以及保健品等方面具有廣泛的應用價值[10]。

支鏈淀粉含量高的糯高粱易于糊化[11]，非常適合于釀酒有益微生物的生長繁殖和香味物質代謝。另外，在加工黃酒的過程中，糯性高粱吸水率較快、飽和吸水量較低，糊化溫度低，具有省水節能的優勢；且糯高粱價格要低于黍米、糯米等常用的黃酒釀造原料，采用糯高粱為原料釀制黃酒能夠大幅降低原料成本，增加企業利潤。因此，本研究提出以糯高粱為原料，釀酒大曲為糖化劑進行糖化發酵，在參考近年學者[12-14]采用響應面法優化工藝過程的基礎上，利用Box-Behnken響應面法[15]對糯高粱糖化工藝進行優化，得到最佳工藝條件，使釀出的糯高粱黃酒富含大量氨基酸、糖和風味物質，使酒體更加有營養，創制一種新型的保健酒，并為其工業化生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

晉糯3號糯高粱：產于山西省農科院高粱研究所試驗田；大曲：購自山西汾陽某制曲廠（以大麥、豌豆為原料，大麥∶豌豆=6∶4）；黍米、藜麥：市售。

福林酚：北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（純度＞97%）：梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；乙醇、乙酸鉀、三氯化鋁、碳酸鈉、鹽酸、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、氫氧化鈉等均為市售分析純；沒食子酸（分析純）、蘆丁（純度為95%）：美國西格瑪-奧德里奇公司；分析試驗用水為18.2MΩ超純水，釀造用水為市政自來水。

1.2 儀器與設備

EBC-LF麥芽標準粉碎機：麥科儀科技有限公司；AL204電子天平：瑞士梅特勒-托利多集團；UV-3300紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糖化工藝

首先將糯高粱清洗，去除雜質與浮土，晾干后用粉碎機粉碎，過18目篩備用。稱取200 g篩上物加入120 mL沸水攪拌均勻加蓋潤糧12h。蒸鍋水開后將糯高粱上鍋蒸120min，期間曬水攪拌一次，保證將糯高粱蒸熟蒸透，攤涼后拌曲加水進行糖化，糖化結束后，測定糖化液中還原糖含量。

1.3.2 單因素試驗

選擇糖化過程的關鍵控制因素——加曲量、糖化時間、糖化溫度3個單因素，通過單因素試驗探討其對糯高粱糖化過程中還原糖含量的影響。

（1）加曲量的影響

準確稱取200g粉碎好的糯高粱，加沸水120 mL于室溫潤糧12 h后上蒸鍋蒸熟，攤涼至室溫后置于1 L燒杯中，拌入質量為糯高粱干質量5%、10%、15%、20%、25%的大曲，并加入煮沸殺菌的涼白開水使糧水比為1∶2（g∶mL），于55 ℃糖化24 h。

（2）糖化時間的影響

準確稱取200 g粉碎好的糯高粱，加沸水120 mL于室溫潤糧12 h后上蒸鍋蒸熟，攤涼至室溫后置于1 L燒杯中，稱質量，拌入質量為糯高粱干質量15%的大曲，并加入煮沸殺菌的涼白開水使糧水比為1∶2（g∶mL），于55 ℃分別糖化3 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h。

（3）糖化溫度的影響

準確稱取200g粉碎好的糯高粱，加沸水120mL于室溫潤糧12 h后上蒸鍋蒸熟，攤涼至室溫后置于1 L燒杯中，稱質量，拌入質量為糯高粱干質量15%的大曲，并加入煮沸殺菌的涼白開水使糧水比為1∶2（g∶mL），分別于45℃、50℃、55℃、60℃、65℃糖化24 h。

1.3.3 響應面優化試驗

根據單因素試驗結果，采用響應面分析法優化糖化工藝參數，得出最佳糖化條件。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 糖化工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for saccharification process optimization

1.3.4 分析測試

（1）還原糖含量測定

將糖化液攪勻后取醪液5 mL置于10 mL離心管于4 000 r/min離心10 min，取上清液經0.45μm濾膜過濾得澄清醪液。醪液還原糖含量的測定采用斐林試劑法[16]。

（2）總多酚含量的測定

采用福林酚法[17]測定黃酒中的總多酚含量，根據實際情況略有改動。將樣品稀釋20倍，吸取200μL置于5mL容量瓶中，加入1 mol/L福林酚試劑0.75 mL混勻，加入質量分數20%的Na2CO3溶液1mL混勻，蒸餾水定容至5mL。30℃避光水浴90min，冷卻至室溫后于波長765nm處測定吸光度值。以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，總酚含量以沒食子酸計。

（3）總黃酮含量的測定

總黃酮含量的測定采用乙酸鉀/氯化鋁[18]法，根據實際情況略有改動。準確吸取200μL樣品置于5 mL容量瓶中，加入0.75 mL三氯化鋁（0.1 mol/L）和1 mL乙酸鉀溶液（1 mol/L），蒸餾水定容至5 mL，充分搖勻后室溫避光反應30 min，4 000 r/min離心10 min。取上清液于波長420 nm處檢測其吸光度值。以蘆丁為標準品繪制標準曲線，總黃酮含量以蘆丁計。

（4）體外抗氧化活性試驗

抗氧化活性分析選用DPPH法[19]。準確稱取10mg DPPH，用體積分數為95%的乙醇溶液超聲輔助溶解，定容至100 mL，置于-20℃冰箱中保存，隨用隨取。精密吸取20 mL母液，用體積分數為95%乙醇定容至100 mL，此工作液的濃度即為50μmol/L[20-21]。精密吸取20μL、40μL、60μL、80μL、100μL黃酒液，蒸餾水補齊至200μL，加入3 mL工作液，避光室溫反應90 min，4 000 r/min離心10 min后于波長517 nm處比色[22]，測定的吸光度值記作As。以體積分數為95%乙醇代替DPPH工作液，所測得吸光度值記作Ar。吸取200μL蒸餾水，加入3 mL工作液，避光室溫反應90 min，于波長510 nm處比色，測定的吸光度值記作A0，DPPH自由基清除率按下式計算：

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 加曲量對糯高粱黃酒糖化過程還原糖含量的影響

本試驗糖化劑為大曲，不同加曲量對還原糖含量的影響結果見圖1。由圖1可知，隨著加曲量的增加，糯高粱黃酒糖化過程的還原糖含量先急劇增加，后趨于平緩，當加曲量為15%時，糖化液的還原糖含量達到最大值，繼續提高加曲量還原糖的含量沒有顯著升高。因此，最佳加曲量為糯高粱干質量的15%。

圖1 加曲量對還原糖含量的影響Fig.1 Effect of Daqu inoculum on reducing sugar contents

2.1.2 糖化時間對糯高粱糖化過程還原糖含量的影響

圖2 糖化時間對還原糖含量的影響Fig.2 Effect of saccharification time on reducing sugar contents

糖化時間對還原糖含量的影響結果見圖2。由圖2可知，在糖化過程中，隨著時間的推移，大曲中的各種酶類被激活，糊化醪中的淀粉、蛋白質、半纖維素等不溶性高分子物質被大曲中的復合酶系水解成糖類、糊精、氨基酸等可溶性的低分子物質，糖度逐漸增加，當達到24 h后，糊化醪中的還原糖含量隨著糖化時間的延長不再顯著增加，出于經濟的角度，糖化時間30 h為宜。

2.1.3 糖化溫度對糯高粱糖化過程還原糖含量的影響

糖化溫度對還原糖含量的影響結果見圖3。由圖3可知，隨著糖化溫度的升高，糯高粱黃酒釀制過程中還原糖含量呈先增加后減少的趨勢，在糖化溫度為55℃時還原糖含量最大。這是因為糖化溫度較低時，不能充分激活糖化酶的活力，影響熟化淀粉的糖化效果；糖化溫度偏高使得各種淀粉酶失活，淀粉不能被糖化[23]。因此，最佳糖化溫度為55℃。

圖3 糖化溫度對還原糖含量的影響Fig.3 Effect of saccharification temperature on reducing sugar contents

2.2 響應面試驗數據處理及模型擬合

采用Design Export 10.0.3軟件對前期響應面試驗設計所做得的糯高粱糖化數據進行處理，試驗結果見表2，表2中1、7、8、11、17號試驗為中心零點試驗，重復5次，以估計試驗誤差，其他試驗為析因試驗。根據試驗相應值進行因變量與自變量的多元線性回歸和二項式方程擬合，得到還原糖含量Y預測值對自變量的二次多項式回歸方程：Y=17.08+0.27A+0.44B+0.55C-0.14AB-0.13AC+0.14BC-0.33A2-0.96B2-0.49C2。由表3可知，回歸方程模型的P值為0.000 4＜0.01，表明該試驗模型顯著；失擬項P值為0.257 4＞0.05，說明方程對試驗擬合程度良好，可以用此模型對糯高粱糖化工藝進行分析和預測。模型的決定系數R2=0.959 7，說明3因素對還原糖影響中95.97%的試驗數據變異可用此模型解釋。方程模型中加曲量、糖化溫度、糖化時間3個因素均對還原糖含量有顯著影響。回歸方程的各項方差分析結果表明，糖化溫度是影響糯高粱糖化效果的最顯著因素，其次是糖化時間，加曲量在10%～20%范圍內時對糖化工藝的影響最不顯著。

表2 糖化工藝優化響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiments for saccharification process optimization

加曲量、糖化時間、糖化溫度、各因素交互作用對糖化工藝的影響結果見圖4。由圖4可知，在糖化過程中，選擇的參數范圍內存在極值，相比較而言，糖化時間和糖化溫度對糖化工藝的影響最為顯著。由軟件分析得到還原糖的最大響應值為17.32 g/100 mL，對應的加曲量為16.19%，糖化時間為25.49 h，糖化溫度為55.27℃。

圖4 各因素交互作用對還原糖含量影響的響應面與等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factor on reducing sugar contents

2.3 響應面優化條件驗證試驗

根據實際情況，選取工藝參數為加曲量16.2%，糖化時間25.5 h，糖化溫度55.3℃。由表4可知，在此優化條件下，設3個重復，糖化后還原糖平均含量為17.29 g/100 mL，與理論值的相對誤差為0.19%，驗證試驗表明，響應面法對糯高粱糖化工藝的優化是可行的，得到的糖化工藝條件具有實際應用價值。

表4 糖化工藝驗證試驗結果Table 4 Validation experiments results of saccharification process

2.4 黃酒總多酚、總黃酮含量與抗氧化性分析

將糖化完成的醪液自然冷卻后加入糯高粱干質量0.5%的釀酒酵母，攪拌均勻，為使釀成的黃酒達到甜型黃酒標準，向糖化完成的醪液中加入體積分數為醪液7.5%的糟燒白酒（酒精度為75%vol），封口，置于18℃的恒溫箱中后發酵45d，期間每隔一星期攪拌一次。將發酵完成后的醪液壓榨過濾，于78℃滅菌30 min，調整酒精度為14%vol，制成成品糯高粱黃酒。

本研究對以糯高粱、黍米、藜麥3種雜糧為主要原料，采用相同的輔料、工藝釀造而成的3種黃酒進行分析，對比其多酚含量與抗氧化活性。酒樣1為糯高粱黃酒，酒樣2為黍米黃酒，酒樣3為藜麥黃酒，均為實驗室自制，測樣前均調整酒精度為14%vol。

2.4.1 三種黃酒的品質指標

三種成品黃酒均具有黃酒特有的香氣，口感香甜醇和，酒味濃郁，高粱黃酒色澤黃亮帶紅，清澈透明，黍米黃酒金黃發亮，清澈透明，藜麥黃酒帶紅亮透明，清澈透明。按照GB/T 13662—2008《黃酒》中給出的甜型黃酒測試方法對三種黃酒的相關指標測試，結果如表5所示，三種黃酒的相關理化指標均符合GB/T 13662—2008《黃酒》中傳統甜型黃酒的限值規定。

表5 三種黃酒的理化指標Table 5 Physical and chemical indexes of three kinds of Chinese cereal wine

2.4.2 三種黃酒總多酚含量

圖5 三種黃酒總多酚含量Fig.5 Total polyphenol contents in three types of Chinese cereal wine

以沒食子酸為標準品，準確移取沒食子酸質量為0、2μg、4μg、6μg、8μg、10μg、12μg、16μg、20μg的標準品，按照實驗方法處理后于765 nm處測其吸光度值，以吸光度值（y）為縱坐標，以沒食子酸當量（x）為橫坐標繪制標準曲線，其回歸方程為y=0.037 1x+0.009 9，R2=0.999 5。根據標準曲線回歸方程計算出三個黃酒樣品中總多酚含量（每個樣品3次重復）。

三個黃酒樣品中高粱黃酒的總多酚含量最高，為0.71 mg/mL，其次為藜麥黃酒0.69 mg/mL，黍米黃酒最低，為0.47 mg/mL。

2.4.3 三種黃酒總黃酮含量

以蘆丁為標準品，準確移取蘆丁當量為0.005mg、0.01mg、0.015 mg、0.02 mg、0.025 mg、0.03 mg、0.035 mg的蘆丁標準液按照實驗方法處理后于波長420 nm處測其吸光度值，以吸光度值（y）為縱坐標，以蘆丁當量（x）為橫坐標繪制標準曲線，其回歸方程為y=6.467 5x+0.004 7，R2=0.999 5。根據標準曲線回歸方程計算出三個黃酒樣品中總黃酮含量（每個樣品3次重復）。

三種黃酒中總黃酮含量差異明顯，藜麥黃酒中總黃酮含量最多，達到了7.39 mg/L，其次為高粱黃酒總黃酮含量1.12 mg/L，黍米黃酒總黃酮含量最低，為0.17 mg/L。

圖6 三種黃酒總黃酮含量Fig.6 Total flavonoid contents in three types of Chinese cereal wine

2.4.4 三種黃酒抗氧化活性分析

圖7 不同添加量的三種黃酒DPPH自由基清除率Fig.7 DPPH free radical scavenging rate of three kinds of Chinese cereal wine with different addition

根據實驗方法測定三種黃酒的DPPH體外自由基清除率，結果見圖7。由圖7可知，表明三種黃酒都有一定的DPPH自由基清除能力，表現出一定的抗氧化活性。其中，高粱黃酒的抗氧化活性最強，當黃酒的加入量為80μL時已達反應平衡，當黃酒加入量為100μL時，DPPH自由基清除率為94.61%。其次是藜麥黃酒，當黃酒加入量為100μL時，總DPPH自由基清除率為71.45%。黍米黃酒的DPPH自由基清除能力最弱，當黃酒加入量為100μL時，DPPH自由基清除率為41.89%。

三種黃酒都含有一定量的總多酚、總黃酮，均表現出了比較強的自由基清除能力。高粱黃酒的總多酚含量與藜麥黃酒相差不大，黍米黃酒總多酚含量不及高粱與藜麥黃酒。藜麥黃酒總黃酮含量最高，是高粱黃酒的6.6倍，黍米黃酒的43.5倍，在體外DPPH自由基清除率方面，高粱黃酒的自由基清除能力最強，這與闕斐等[6]的研究結論——多酚含量越高，抗氧化能力越強，基本一致，但黃酒中還含有維生素C、維生素E及其他抗氧化活性物質，這也解釋了高粱黃酒與藜麥黃酒多酚含量相近，但高粱黃酒的抗氧化性顯著高于藜麥黃酒。黍米黃酒的總多酚、總黃酮含量都最低，其DPPH自由基清除能力也最弱。

3 結論

本研究通過單因素及響應面試驗得到糯高粱釀造黃酒糖化工藝的最佳工藝條件為，加曲量為糯高粱干質量的16.2%，糖化時間25.5 h，糖化溫度55.3℃，各因素對還原糖含量的影響次序依次為：糖化溫度＞糖化時間＞加曲量。采用響應面法優化得到的工藝參數可靠，對實際糖化工藝有一定的指導意義。三種黃酒均含有總多酚、總黃酮，均具有一定的DPPH自由基清除活性，高粱黃酒總多酚含量最高，藜麥黃酒總黃酮含量最高。在抗氧化性方面，高粱黃酒的DPPH自由基清除率最高，比藜麥黃酒與黍米黃酒更具優勢。

參考文獻：

[1]倪 莉，呂旭聰，黃志清，等.黃酒的生理功效及其生理活性物質研究進展[J].中國食品學報，2012，12（3）：1-7.

[2]王興龍，袁 敏，袁留征，等.黃酒中安全風險性物質及控制的研究進展[J].食品與發酵科技，2015，51（1）：96-100.

[3]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 13662—2008黃酒[S].北京：中國標準出版社，2008.

[4]謝廣發，戴 軍，趙光鰲.科學認識黃酒的保健養生功能[J].中國釀造，2004，23（1）：30-31.

[5]孟如杰.黃酒中抗氧化活性物質的研究[D].無錫：江南大學，2008.

[6]闕 斐，張星海，龔 恕，等.保健黃酒抗氧化活性及其中酚類物質的比較[J].中國釀造，2008，27（11）：62-64.

[7]袁 蕊，敖宗華，丁海龍，等.高粱黃酮的提取及其測定方法的建立[J].北京工商大學學報：自然科學版，2011，29（4）：42-45.

[8]耿敬章，馮君琪.黃酮類化合物的生理功能與應用研究[J].中國食物與營養，2007（4）：19-21.

[9]趙揚帆，鄭寶東.植物多酚類物質及其功能學研究進展[J].福建輕紡，2006（11）：107-110.

[10]李 健，楊昌鵬，李群梅，等.植物多酚的應用研究進展[J].廣西輕工業，2008，24（12）：1-3，9.

[11]范志勇，左國營，杜新勇，等.高粱原料的不同對醬香型白酒產酒情況的影響[J].釀酒，2014，41（4）：36-41

[12]劉 新，李新生，吳三橋，等.響應面法優化橘汁糯米粉糖化醪液制備工藝[J].食品科學，2012，33（2）：84-88.

[13]吳美媛，王喜周，余甜女，等.Box-Behnken效應面法優化微波提取猴頭菇多糖工藝[J].食品研究與開發，2014，35（9）：23-26，35.

[14]黨 婭，劉水英.響應面法優化紫薯汁糖化工藝研究[J].中國釀造，2014，33（8）：55-59.

[15]李 莉，張 賽，何 強，等.響應面法在試驗設計與優化中的應用[J].實驗室研究與探索，2015，34（8）：41-45.

[16]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 15038—2006葡萄酒，果酒通用分析方法[S].北京：中國標準出版社，2006.

[17]SINGLETON V L,ROSSI J A,Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents[J].Am J Enol Viticult,1965,16：144-158.

[18]中華人民共和國農業部，中國國家標準化管理委員會.NY/T 1295—2007蕎麥及其制品中總黃酮含量的測定[S].北京：中國標準出版社，2007.

[19]SCHERERR,GODOY H T.Antioxidant activity index(AAI)by the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl method[J].Food Chem,2009,112(3)：654-658.

[20]SHARMA OP,BHAT T K.DPPH antioxidant assay revisited[J].Food Chem,2009,113(4)：1202-1205.

[21]THAIPONG K,BOONPRAKOB U,CROSBY K,et al.Comparison of ABTS,DPPH,FRAP,and ORAC assays for estimating antioxidant activity from guava fruit extracts[J].J Food Comp Anal,2006,19(6/7)：669-675.

[22]韋獻雅，殷麗琴，鐘 成，等.DPPH法評價抗氧化活性研究進展[J].食品科學，2014，35（9）：317-322.

[23]蘭 瑩，覃玉全，汪 超，等.糯米黃酒釀制的糖化工藝[J].湖北農業科學，2012，51（10）：2089-2091.