響應(yīng)面法優(yōu)化帝國世濤啤酒釀造工藝的研究

王 超，金德強(qiáng)，翟乃明，董小雷*

（齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點(diǎn)試驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250353）

黑啤酒的歷史始于1795年，起源于德國[1]，當(dāng)年阿瑟健力士于愛爾蘭的都柏林開設(shè)了一家釀酒廠，該種啤酒使用了大量的烘烤麥芽[2]，麥芽的抗氧化性強(qiáng)，因此其保質(zhì)期往往比其他種類的啤酒要長，對于啤酒的銷售和貯存有積極的影響[3]。黑啤主要分為下面發(fā)酵啤酒（如德國黑啤、慕尼黑黑?。┖蜕厦姘l(fā)酵啤酒（如波特啤酒、世濤啤酒），其中世濤啤酒分為牛奶世濤、燕麥?zhǔn)罎?、愛爾蘭世濤、巧克力世濤、帝國世濤及特種世濤[4]。

目前，中國雖然是啤酒生產(chǎn)大國，總產(chǎn)量已經(jīng)穩(wěn)居世界第一[5]，但對淡色啤酒的研究居多，而黑啤酒尤其是世濤啤酒的研究則非常少。世濤啤酒以其豐富的口味和其包容性在西方國家發(fā)展迅猛[6]，吸引著廣大啤酒愛好者的追捧，并且特種麥芽（巧克力麥芽、焦香麥芽、結(jié)晶麥芽、黑麥芽和燕麥）的比例大大提升，這使世濤啤酒具有更高的酒精度、濃烈的烘烤大麥焦糊味、更加豐富的層次感，以及無限拓展的空間，其中帝國世濤啤酒則最能體現(xiàn)世濤的風(fēng)格特色[7]，并且其在酒精度及烘焙麥芽（增強(qiáng)抗氧化性）等方面也是比其他世濤啤酒要高，因此在銷售和貯存方面相對于其他世濤啤酒更具有優(yōu)勢。

針對我國對于帝國世濤啤酒研究匱乏的現(xiàn)狀[8]，本研究利用特種麥芽，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面試驗(yàn)對帝國世濤啤酒釀造工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的釀造工藝條件，以期得到具有中國特色的帝國世濤啤酒釀造工藝，確保其在精釀啤酒的生產(chǎn)及大規(guī)模生產(chǎn)中的科學(xué)性和可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥芽（澳麥、巧克力麥芽、焦香麥芽、結(jié)晶麥芽、黑麥芽和燕麥，其色度分別為5 EBC、500EBC、100 EBC、150 EBC、1 200 EBC）：永順泰（昌樂）麥芽有限公司；白砂糖：濟(jì)南長清家家悅超市；卡斯卡特酒花顆粒：張掖斯丹納酒花有限公司；上面發(fā)酵啤酒酵母US-05：齊魯工業(yè)大學(xué)中德啤酒中心保藏；鄰苯二胺（分析純）：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；氯化鈉（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙醇（色譜純）：東莞市喬科化學(xué)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)：蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；UV2350分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；WGZ-2PJ啤酒濁度儀、SD9012B EBC色度計(jì)：上海昕瑞儀器儀表有限公司；WYT-J手持糖度計(jì)：上海壘固儀器有限公司；ZM30L立式自控發(fā)酵罐：濟(jì)南正麥機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 帝國世濤啤酒的工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

原料配比：將5種麥芽按照此比例進(jìn)行配比，澳麥51%、巧克力麥芽8%、焦香麥芽15%、結(jié)晶麥芽15%、黑麥芽6%、燕麥5%。

麥芽粉碎[9]：大麥芽加水濕粉碎，皮殼破而不碎；巧克力麥芽、焦香麥芽、結(jié)晶麥芽、黑麥芽粉碎，皮殼破而不碎；燕麥磨成細(xì)粉。

原料糖化[10]：采用單醪浸出糖化法，控制料水比1∶3（kg∶L），邊攪拌邊投料使料水充分混勻，投料完畢，醪液溫度為45℃，維持15 min；升溫至52℃，維持20 min；升溫至65℃，維持60 min。升溫至78℃，糖化完成。

麥汁過濾：麥汁轉(zhuǎn)移至過濾槽前，添加78℃水至過濾槽，水量剛好沒過篩板即可。麥汁入過濾槽，靜置20 min，回流，過濾，過濾速度由慢至快，保證獲得的麥汁清亮、干凈、無污染。過濾結(jié)束，洗糟兩次，洗糟水溫度控制在76～78℃。

麥汁煮沸[11]：將過濾、洗糟結(jié)束所得到的麥汁煮沸70 min。分三次添加0.45 g/L卡斯卡特啤酒花顆粒。初沸第10 min添加60%的啤酒花顆粒，煮沸第30 min添加20%啤酒顆粒，煮沸第60 min添加20%啤酒花顆粒。煮沸結(jié)束，將麥汁轉(zhuǎn)入回旋沉淀槽，靜置20 min，分離凝固物。

發(fā)酵及二次發(fā)酵[12]：添加上面發(fā)酵酵母US-05，為保證酵母充分利用麥汁中營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長繁殖，酵母接種量控制在（1.0～1.5）×107個(gè)/mL[13]。將麥汁轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐，冷卻過程中對麥汁進(jìn)行充氧，充氧量控制在8～10 mg/L，控制麥汁冷卻溫度在19.5～20.0℃范圍，以保證酵母能夠正常生長繁殖。發(fā)酵期間，當(dāng)糖度為5.5°P時(shí)封罐，帝國世濤啤酒中的可發(fā)酵性糖無明顯下降時(shí)，在另一發(fā)酵罐加入白砂糖，把帝國世濤導(dǎo)入該發(fā)酵罐中，15℃二次發(fā)酵至糖度為2～3°P時(shí)結(jié)束。

后貯[14]：待雙乙酰含量＜0.15 mg/L，先以1.5℃/h降至5℃左右，保溫保壓24 h，再以1℃/L降至0.5℃左右，冷貯啤酒，進(jìn)行啤酒風(fēng)味物質(zhì)分析檢測。注意降溫過程中觀察發(fā)酵罐壓力變化，使發(fā)酵罐壓力控制在0.14～0.16 MPa，壓力＜0.14 MPa時(shí)及時(shí)補(bǔ)充外源二氧化碳，確保啤酒強(qiáng)烈的殺口力。

1.3.2 單因素優(yōu)化試驗(yàn)

采用單因素變量控制法進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察原麥汁濃度（12 °P、14°P、16 °P、18°P、20 °P）、白砂糖添加量（3%、4%、5%、6%、7%）、發(fā)酵溫度（14℃、16℃、18℃、20℃、22℃）對帝國世濤啤酒感官評分的影響。

1.3.3 釀造工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以感官評分（Y）為響應(yīng)值，對發(fā)酵溫度（A）、原麥汁濃度（B）、白砂糖添加量（C）進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 帝國世濤啤酒釀造工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for brewing process optimization of Imperial Stout Beer

1.3.4 感官評價(jià)及理化檢測方法

（1）感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

邀請10名啤酒感官品評專家，分別從泡沫、香氣、口味3方面對試驗(yàn)樣品進(jìn)行感官評分，滿分為100分。感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 帝國世濤啤酒的感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of Imperial Stout Beer

（2）理化指標(biāo)的檢測方法

雙乙酰、色度、濁度、苦味值及總酸的測定：參考GB/T 4927—2008《啤酒》中的方法[15]；酒精度的測定：參考GB 5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測定》中的酒精計(jì)法；pH：采用pH計(jì)直接測量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度對帝國世濤啤酒感官評分的影響

發(fā)酵溫度對帝國世濤啤酒感官評分的影響結(jié)果見圖1。

圖1 發(fā)酵溫度對帝國世濤啤酒感官評分的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on the sensory score of Imperial Stout Beer

由圖1可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，啤酒感官評分先增高后降低。發(fā)酵溫度為18～22℃時(shí)，啤酒感官評分＞80分，這可能是因?yàn)楫?dāng)發(fā)酵溫度較低時(shí)，上面酵母發(fā)酵速度緩慢，產(chǎn)生的香味淡?。划?dāng)發(fā)酵溫度為20℃時(shí)，感官評分達(dá)到最大值，給人以濃烈的烘烤大麥焦糊味、更加豐富和有層次感的口味。當(dāng)發(fā)酵溫度為22℃時(shí)，酵母發(fā)酵速度快，代謝產(chǎn)生高級醇等含量高，對整體口感影響大。因此，選擇發(fā)酵溫度20℃為宜。

2.1.2 原麥汁濃度對帝國世濤啤酒感官品評的影響

原麥汁濃度對帝國世濤啤酒感官評分的影響見圖2。

圖2 原麥汁濃度對帝國世濤啤酒感官評分的影響Fig.2 Effect of the original wort concentration on the sensory score of Imperial Stout Beer

由圖2可知，隨著原麥汁濃度的增加，啤酒感官評分呈先增加后減少的趨勢；當(dāng)原麥汁濃度為15°P時(shí)，啤酒感官評分最高，為91分，其帶有適度的咖啡、深色可可、烘培味道，酒體厚重，給人黏稠、綿密的感受。繼續(xù)增加原麥汁濃度，啤酒感官評分開始下降；因?yàn)樵溨瓭舛鹊淖兓苯訉?dǎo)致麥汁組分發(fā)生改變，隨著原麥汁濃度的升高，酵母細(xì)胞活力及其發(fā)酵性能也會(huì)隨之發(fā)生相應(yīng)的變化，影響酵母發(fā)酵產(chǎn)生的香味物質(zhì)[16]，進(jìn)而對感官品評產(chǎn)生影響。因此，選擇原麥汁濃度為15°P。

此外，還應(yīng)大力開發(fā)度假類型的旅游產(chǎn)品。如今人們生活水平提高了，精神層面的需求更加旺盛，都市的繁忙和緊張的生活節(jié)奏使得人們對于古鎮(zhèn)緩慢、安逸的氣息充滿向往和渴求，同時(shí)隨著城市化進(jìn)程的加快，新農(nóng)村建設(shè)步步推進(jìn)，古色古香的鄉(xiāng)村氛圍，自然清新的生態(tài)環(huán)境也越來越少，霍童古鎮(zhèn)自然環(huán)境優(yōu)越，能夠滿足都市人群對于淳樸生活的追求。古鎮(zhèn)應(yīng)增加建設(shè)度假型山莊、農(nóng)家樂、鄉(xiāng)村木屋、帳篷酒店等住宿場所，滿足不同年齡階段不同消費(fèi)水平游客的住宿需求，同時(shí)增加收益。

2.1.3 白砂糖添加量對帝國世濤啤酒感官品評的影響

白砂糖添加量對帝國世濤啤酒感官評分的影響見圖3。

圖3 白砂糖添加量對帝國世濤啤酒感官評分的影響Fig.3 Effect of sugar addition on the sensory score of Imperial Stout Beer

由圖3可知，隨著白砂糖添加量的增加，啤酒感官評分呈先增加后減少的趨勢；當(dāng)白砂糖添加量為5%時(shí)，啤酒感官評分最高。這可能是由于白砂糖對啤酒的醇厚度等會(huì)產(chǎn)生一定的影響，隨著白砂糖添加量的增加，啤酒的醇厚度等也會(huì)增加，當(dāng)白砂糖添加量＞5%時(shí)，其在二次發(fā)酵過程中，啤酒醇厚度等重要指標(biāo)會(huì)過度增加。因此，選擇白砂糖添加量為5%。

2.2 帝國世濤啤酒響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表3，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析包括響應(yīng)面二次模型的方差分析及響應(yīng)面二次模型的擬合分析見表4。

表3 帝國世濤啤酒釀造工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments for brewing process optimization of Imperial Stout Beer

使用Design-Expert 7.0對試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)（表3）進(jìn)行分析，得到二次回歸方程為：

表4 響應(yīng)面二次模型的方差分析及擬合分析Table 4 Variance and fitting analysis of response surface quadratic model

由表4可知，3個(gè)因素的影響大小為：B（原麥汁濃度）＞C（白砂糖添加量）＞A（發(fā)酵溫度）；一次項(xiàng)B、C、二次項(xiàng)A2、C2對感官評分的結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)A、交互項(xiàng)BC及AC的對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他因素對結(jié)果影響不顯著；模型P=0.000 3＜0.01，說明該模型極顯著，失擬項(xiàng)P=0.950 6＞0.05，表明模型失擬不顯著[17]。

相關(guān)系數(shù)R2=0.9631，接近于1，表明二次多項(xiàng)式方程能充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，方程擬合度很好。校正相關(guān)系數(shù)R2adj=0.9157，說明響應(yīng)值的變化有93.27%來源于所選變量，該試驗(yàn)中變異系數(shù)（coefficientof variation，CV）為1.34%＜5%，說明該試驗(yàn)的精確度和試驗(yàn)重復(fù)性很高。校正相關(guān)系數(shù)R2adj=0.915 7和預(yù)測相關(guān)系數(shù)R2pred=0.902 2很接近，且信噪比為13.123，表明所建立的模型可用于優(yōu)化帝國世濤啤酒發(fā)酵工藝條件的分析[18]。

采用Design-Expert 7.0軟件根據(jù)回歸方程繪制等高線和響應(yīng)面圖[19]，如圖4所示。由圖4可知，發(fā)酵溫度和白砂糖添加量交互作用及原麥汁濃度和白砂糖添加量交互作用顯著，與表4中的交互相P值的分析結(jié)果一致。響應(yīng)面的坡度較為陡峭，表明感官品評的響應(yīng)值對發(fā)酵溫度、原麥汁濃度、白砂糖添加量的變化較為敏感[20]。在發(fā)酵溫度不變的條件下，隨著白砂糖添加量的增加，響應(yīng)值先逐漸升高再逐漸降低；在白砂糖添加量不變的條件下，隨著發(fā)酵溫度的升高，響應(yīng)值先逐漸升高再逐漸降低[21]。在原麥汁濃度不變的條件下，隨著白砂糖添加量的增加，響應(yīng)值先逐漸升高再逐漸降低；在白砂糖添加量不變的條件下，隨著原麥汁濃度的升高，響應(yīng)值逐漸升高。

圖4 發(fā)酵溫度、原麥汁濃度和白砂糖添加量交互作用對感官評分影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,original wort concentration and sugar addition on the sensory score

2.3 帝國世濤啤酒檢測分析結(jié)果

對優(yōu)化后的帝國世濤啤酒進(jìn)行理化指標(biāo)進(jìn)行檢測分析。結(jié)果表明，其理化指標(biāo)為雙乙酰0.12 mg/L，色度458.5 EBC，濁度0.8 EBC，酒精度9.5%vol，苦味值55 BU，總酸2.79 mL/100 mL。其雙乙酰、色度、酒精度等均符合GB/T 4927—2008《啤酒》中的國家標(biāo)準(zhǔn)；所釀帝國世濤啤酒深褐色至深棕色，泡沫細(xì)膩，掛杯時(shí)間長；濃郁且多樣，有著程度變化的烘焙谷物香，麥芽香，水果酯香，酒花香和酒精香味；酒體厚重，有嚼勁，帶有柔軟、甜美的質(zhì)感。參考啤酒感官品評[22]和GB/T 4927—2008《啤酒》中的國家標(biāo)準(zhǔn)可知，優(yōu)化后的帝國世濤啤酒符合國家標(biāo)準(zhǔn)，具有消費(fèi)者所喜愛的特殊風(fēng)味，其理化指標(biāo)和感官品評結(jié)果對其發(fā)展提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，可適用于精釀啤酒和工業(yè)化啤酒的生產(chǎn)。

3 結(jié)論

本研究采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法分析對帝國世濤啤酒釀造工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，帝國世濤啤酒最佳釀造工藝條件為：原麥汁濃度16°P，發(fā)酵溫度21℃，白砂糖添加量5.1%。其感官評分為95分，理化指標(biāo)為雙乙酰0.12 mg/L，色度458.5 EBC，濁度0.8EBC，酒精度9.5%vol，苦味值55BU，總酸2.79 mL/100 mL，符合GB/T 4927—2008《啤酒》中的國家標(biāo)準(zhǔn)，具有堅(jiān)實(shí)的理論支持；為精釀啤酒以及工廠生產(chǎn)的可行性提供了堅(jiān)實(shí)的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)，對帝國世濤啤酒在我國的發(fā)展有重要的指導(dǎo)意義。

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