高鹽脅迫下米曲霉FUJX 001產草甘膦降解酶空間結構變化研究

童火艷，王鳳雪，吳曉江，張 鵬，萬 茵，劉成梅，付桂明*

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學 食品學院，江西 南昌 330031；3.南昌大學 中德食品工程中心，江西 南昌 330047）

草甘膦（glyphosate）是一種非選擇性內吸傳導型廣譜有機磷除草劑，具有高效、廣譜、低毒、低殘留、環境友好等優點，已成為世界上應用最廣、用量最大的除草劑[1-2]。由于其化學性質穩定、自然降解速度慢，可通過在飲用水、農作物中殘留等多種途徑進入人體。世界衛生組織（world health organization，WHO）的研究表明[3]，草甘膦會造成小鼠胎仔數的減少及精子數的降低，且人體長期接觸草甘膦后，會導致流產及早產率的升高。隨著它的廣泛應用，草甘膦及其代謝物氨基甲基膦酸的安全性引起人們的普遍關注。大豆發酵食品是中國乃至東亞國家歷史悠久的傳統食品[4]。目前在耐草甘膦的轉基因大豆豆粒里已檢測到草甘膦及其代謝物的殘留[5]。隨著我國對轉基因大豆產品消耗量和進口量的逐年增加，大豆中草甘膦殘留風險將增加。草甘膦在轉基因大豆中殘留、加工過程中的消長及危害已成為研究的熱點[6-8]。

隨著草甘膦的大量使用，其殘留危害和消除策略受到人們的廣泛關注。草甘膦在土壤中的自然降解半衰期約為60 d，其降解方式有光降解、化學降解和微生物降解。微生物降解條件溫和、高效，成為草甘膦降解的未來發展趨勢。能夠降解草甘膦的微生物種類主要有：枯草芽孢桿菌[9]、銅綠假單胞菌[10]、酵母菌[11]、擬青霉[12]和米曲霉[13]等。微生物降解草甘膦的途徑主要有兩個：一個是氨甲基磷酸（aminomethyl phosphonic acid，AMPA）途徑，草甘膦在轉氨酶的作用下C-N鍵氧化斷裂生成為AMPA，再在磷酰基乙酸水解酶（phosphonoacetate hydrolase，PhnA）的作用下C-P鍵斷裂轉化為甲胺和磷酸，甲胺進一步分解成甲醛和氨進入C-N循環；另一途徑是肌氨酸途徑，草甘膦中的C-P鍵經C-P裂解酶直接作用脫磷酸生成肌氨酸（sarcosine），并在肌氨酸氧化酶（sarcosineoxidase，SOX）的作用下進一步分解成甘氨酸[14-16]。

醬油是一種在亞洲國家盛行的具有咸味和獨特風味的大豆類傳統發酵調味品。它是由豆粕和麩皮（或大豆和小麥）的混合原料通過米曲霉制曲發酵，后期添加酵母和乳酸菌進行厭氧發酵，再用鹽水淋洗而成的[17]。米曲霉是食品發酵工業中醬油、豆豉制造的主要生產菌之一。米曲霉純種發酵醬油具有生產工藝條件易于控制、產品質量穩定、安全性高、發酵的醬油口味好、營養豐富[18-19]等優點。本研究以課題組前期篩選到的米曲霉（Aspergillusoryzae）FUJX 001[20]來源的草甘膦降解酶為研究目標，探討高鹽條件下，草甘膦降解酶的空間結構變化，以期為高鹽稀態發酵生產醬油過程中草甘膦殘留的生物酶法消除提供重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉（Aspergillusoryzae）FUJX 001：實驗室篩選的對草甘膦有較高降解率的菌株；葡聚糖凝膠G-150（Sephadex G-150）、葡聚糖凝膠G-50（Sephadex G-50）填料（1.6 cm×45cm）：安發瑪西亞生物技術公司；二乙基氨基乙基（diethyl aminoethyl，DEAE）-葡聚糖凝膠A-50（Sephadex A-50）填料（1.6 cm×45 cm）：上海化學試劑采購供應站分裝廠；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：上海源葉生物科技有限公司；考馬斯亮藍G-250（生化試劑）、Tris-HCl（色譜純）：北京索萊寶科技有限公司；甲醇（色譜純）、溴化鉀、硫酸銨、氯化鈉、亞硝酸鈉、硫酸（均為分析純）：西隴科學股份有限公司；草甘膦（純度≥95%）：成都格拉西亞卡爾科技有限公司。

產酶發酵培養基：酵母膏1 g，硫酸銨2 g，可溶性淀粉3 g，氯化鈉2 g，蒸餾水900 mL，121℃滅菌15 min。添加經0.45μm微孔濾膜過濾草甘膦溶液（10 g/L，pH 7.0）至草甘膦質量濃度為1 g/L。

1.2 儀器與設備

ZDX-35BI型座式蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；DHG-9053型電熱恒溫干燥箱：上海三發科學儀器有限公司；ZHWY-2102C型恒溫培養振蕩器：上海智誠分析儀器制造有限公司；TGL-16B型高速離心機：美國熱電公司；LC-1260型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國安捷倫公司；BS-100A自動部分收集器、HD-1核酸蛋白紫外檢測器：上海青浦瀘西儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）型循環水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；Mili-Q50超純水制備系統：美國Millipore公司；MOS-450/AF-CD圓二色光譜儀（circular dichroism，CD）：法國Bio-Logic公司；F-7000熒光分光光度計、U-2910紫外分光光度計：日本日立（HIATCHI）高新技術公司；Nicolet5700傅里葉紅外光譜（Fourier transforminfrared，FT-IR）：美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 草甘膦誘導米曲霉FUJX 001產酶發酵實驗

對具有降解草甘膦能力的米曲霉（A.oryzae）FUJX 001進行斜面活化，28℃培養3 d，待長出大量孢子時，用無菌生理鹽水（含0.05%Triton X-100）洗脫后制得孢子懸浮液。接種1mL孢子懸浮液于100 mL的產酶發酵培養基，在30℃條件下150 r/min培養2 d獲得種子液，再將100 mL種子液接種到4 L產酶發酵培養基，以2 L/min的流速通入無菌空氣（過0.45μm微孔濾膜），30℃培養5 d。

1.3.2 草甘膦降解酶的純化

將抽濾所得的米曲霉菌絲體置于研缽中，快速加入適量的液氮進行研磨后獲得菌絲體固體粉末。然后將菌絲體與Tris-HCl緩沖溶液（0.05 mol/L、pH 7.0）按1∶10（g∶mL）的比例混合后，在4℃、7 000×g條件下離心30 min，所得上清液即為草甘膦降解酶粗酶液，測定粗酶液中草甘膦降解酶酶活和蛋白質含量。移取草甘膦降解酶粗酶液20 mL，分別向其中緩慢加入研磨過的硫酸銨粉末，使溶液中硫酸銨飽和度最終達到80%，完全溶解后置于4℃條件下過夜，再經4℃、7 000×g條件下離心30 min，獲得沉淀物。用Tris-HCl緩沖溶液將沉淀物溶解定容至10 mL，分別將沉淀溶解液裝入透析袋（截留分子質量為1 500 Da）中，透析48 h，經過間斷時間更換聚乙二醇進行濃縮，待溶液濃縮至原體積1/2后取出，測定硫酸銨沉淀后的草甘膦降解酶酶活和蛋白質含量。經Sephadex G-150柱層析不能達到完全分離的效果，因此將收集的樣品進一步用Sephadex G-50和DEAE-Sephadex A-50純化。經過Sephadex G-150、Sephadex G-50和DEAE Sephadex A-50三級柱層析純化，分別收集每級純化中有草甘膦降解酶活的蛋白峰部分，測定每級柱層析純化后的草甘膦降解酶酶活和蛋白質含量，并將經過DEAESephadex A-50純化后有草甘膦降解酶酶活部分，透析、濃縮、凍干備用。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

運用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）變性凝膠電泳分析草甘膦降解酶純度。純化后的草甘膦降解酶樣品溶于Tris-HCl緩沖溶液，使其蛋白質質量濃度約為1 mg/mL，100℃煮沸5 min，離心取上清液，電泳上樣量10μL。配制SDS-PAGE變性凝膠電泳分離膠（12 g/100 mL）和濃縮膠（5g/100mL），預電泳電壓100V，1h，進入分離膠后調到200 V，考馬斯亮藍R-250染色脫色后，經Multifunction Printer掃描得電泳圖[21]。

1.3.4 草甘膦降解酶酶活力的測定

標準品草甘膦溶液的制備：準確稱取40 mg草甘膦的標準品溶于少量蒸餾水中，待充分溶解后定容至100 mL。用移液槍分別吸取0、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00mL的于100mL容量瓶中，先加入30mL的蒸餾水，再依次加入2 mL硫酸（質量分數50%）、1 mL溴化鉀（2.0mol/L）、2 mL亞硝酸鈉溶液（0.1mol/L），搖勻靜置30min后定容，制得質量濃度依次為0、8.00μg/mL、16.00μg/mL、24.00μg/mL、32.00μg/mL、40.00μg/mL的草甘膦標準品溶液。

取1 mL草甘膦降解酶酶液和9 mL草甘膦溶液（由濃度為0.05 mol/L，pH 7.0的Tris-HCl緩沖溶液配制，草甘膦質量濃度為1g/L）分別經過37℃水預熱5min后，混勻反應30min，沸水終止反應，冷卻至室溫，獲得反應液[20，22]。

參照標準品草甘膦溶液的制備步驟，取2 mL反應液，依次加硫酸、溴化鉀和亞硝酸鈉等試劑對其進行亞硝化處理，再采用HPLC法測定草甘膦含量[23]，分別以有酶無底物和有底物無酶的樣品為空白對照。

色譜條件：ThermoHypersil-ODS色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇∶水=2∶98（V/V）；流速0.8 mL/min；選用紫外檢測器，檢測波長240nm：柱溫25℃；進樣量10μL。

草甘膦降解酶的活力[20]定義為：在溫度為37℃，pH 7.0的條件下，每分鐘分解1μg草甘膦所需酶的量為1個酶活力單位（U）。

1.3.5 蛋白質含量的測定

蛋白質含量采用Bradford法[24]測定，以牛血清白蛋白（BSA）為標準繪制標準曲線。在10 mL試管中加入1 mL草甘膦降解酶粗酶液和5 mL考馬斯亮藍G-250染液，混勻，室溫靜置5 min后在波長595 nm處測定光吸光度值。根據牛血清白蛋白標準曲線回歸方程，計算粗酶液蛋白質含量。

比酶活、蛋白回收率、酶活回收率、純化倍數的計算公式如下：

1.3.6 傅里葉紅外光譜分析檢測

將經1.3.2制備的草甘膦降解酶樣品分別用蒸餾水、15%NaCl溶液和20%NaCl溶液配制成質量濃度為0.1mg/mL樣液，混勻靜置10 s后凍干成粉末，在紅外燈下研磨成細小的粉末，直至可以壓片，然后用壓片機壓成透明的薄片，在波數500～4 000 cm-1條件下掃描得到紅外光譜。

1.3.7 紫外-可見光掃描圖譜分析檢測

將經1.3.2制備的草甘膦降解酶樣品分別用蒸餾水、15%NaCl溶液和20%NaCl溶液配制成質量濃度為0.07 mg/mL的樣液，并進行波長180～500 nm范圍的波段掃描，觀察其在波長范圍內主要特征吸收峰以及不同鹽濃度對酶的吸收波長和吸光強度的影響。

1.3.8 圓二色光譜分析檢測

將經1.3.2制備的草甘膦降解酶樣品分別用蒸餾水、15%NaCl溶液和20%NaCl溶液將其稀釋相同的倍數，至草甘膦降解酶的質量濃度為0.1mg/mL，采用圓二色譜儀進行分析檢測。

檢測條件：掃描波長190～260nm，掃描速度100nm/min，分辨率0.000 6 mdeg，光譜間隔0.1 nm。實驗值采取3個平行樣的掃描平均值。根據草甘膦降解酶分子中氨基酸的α-碳原子不對稱性和主鏈構象的不對稱而具有的光學特性，利用在線dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml軟件分析其二級結構的組成情況。

1.3.9 熒光光譜分析檢測

分別用蒸餾水、15%NaCl溶液和20%NaCl溶液將1.3.2制備的草甘膦降解酶樣品稀釋質量濃度為0.03 mg/mL樣液，采用熒光光譜儀分析樣品的熒光強度及熒光吸收波長。

檢測條件：激發波長280 nm，掃描光譜的波長范圍為300～500 nm，發射與激發狹縫均為5 nm[25]，樣品檢測量為3 mL。

2 結果與分析

2.1 草甘膦降解酶的純化

由表1可知，米曲霉（A.oryzae）FUJX 001經液氮研磨，與Tris-HCl緩沖液按一定比列混合后，經離心獲得發酵上清液100 mL，測得總蛋白質量為156.40 mg，總酶活為1 686 U。經Sephadex G-150柱層析獲得的目的酶經SDS-PAGE電泳后，發現仍有一些分子質量較小且不等的雜條帶，這可能是由于Sephadex G-150凝膠填料不能達到完全分離的效果，因此進一步采用Sephadex G-50和DEAE-Sephadex A-50柱層析純化。經過Sephadex G-150、Sephadex G-50和DEAESephadex A-50柱層析純化后，酶活回收率分別為51.84%、43.40%和36.21%，純化倍數分別為1.64、2.42和2.76，說明經過此三步柱層析方法純化草甘膦降解酶達到較為理想的效果。

表1 米曲霉中草甘膦降解酶的分離純化結果Table 1 Results of separation and purification of glyphosate degradation enzyme from A.oryzae

2.2 草甘膦降解酶的分子質量

對純化后的草甘膦降解酶樣品進行SDS-PAGE電泳實驗，結果如圖1所示。由圖1可知，經DEAE-Sephadex A-50柱層析分離純化后得到的草甘膦降解酶樣品有明顯的單一條帶，分子質量約為34.7 kDa，表明草甘磷降解酶純度較高，達到電泳純。

圖1 經DEAE-Sephadex A-50柱純化后草甘膦降解酶的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis of glyphosate degradation enzyme after purification by DEAE-Sephadex A-50 column

2.3 高濃度NaCl對草甘膦降解酶結構的影響

目前國內大部分以米曲霉發酵生產醬油采用高鹽稀態醬油發酵，發酵時鹽濃度范圍為15～25%。研究在此高鹽濃度脅迫下，高鹽離子濃度和高滲透壓對米曲霉中草甘膦降解酶分子空間構象的影響，為研究發酵轉基因大豆生產醬油中降解草甘膦提供研究基礎。因此本實驗研究15%和20%NaCl溶液對草甘膦降解酶結構的影響。

2.3.1 傅里葉紅外光譜檢測結果

紅外光譜是一種可以獲知分子化學基團組成和確定物質化學式的高效靈敏的檢測方法，其主要是依據光的吸收和電子的躍遷。經15%和20%NaCl溶液處理后，草甘膦降解酶的傅里葉紅外光譜檢測結果見圖2。由圖2可知，在4 000～2 900 cm-1氫鍵區，可能由O-H、C-H和N-H基團振動吸收引起，其峰寬、強度大。其中3 390 cm-1處為O-H和N-H伸縮振動區，可能由N-H鍵伸縮振動引起，2 977.45 cm-1為C-H伸縮振動區，可能是-CH3鍵引起，2 595 cm-1為S-H伸縮振動區，附近可能由S-H基團產生吸收峰。1635～1550cm-1吸收峰可能是C-N鍵和C=O鍵的振動吸收，1 554 cm-1處對應酰胺Ⅱ帶，且1 630 cm-1左右振動吸收對應分子內β-折疊。在1 460～1 000 cm-1范圍內可能由CH2鍵的搖擺振動吸收引起，1 300～1 295 cm-1范圍內吸收峰可能是由氨基酸分子內仲酰胺N-H鍵彎曲、C-H鍵的延伸或兩者間耦合造成的酰胺Ⅲ帶所致，1 296 cm-1為C-C伸縮振動區，可能是由CH3鍵的變性、C-N鍵延伸引起。1 140 cm-1、1 042 cm-1附近特征吸收峰分別對應分子中C-C、C-OH的伸縮振動[26-27]。在900～850 cm-1之間吸收峰可能是C-C鍵和羧基上的OH鍵延伸所致。

圖2 高濃度NaCl對草甘膦降解酶紅外光譜的影響Fig.2 Effect of high concentration NaCl on infrared spectroscopy of glyphosate degradation enzyme

由圖2可知，15%和20%的NaCl溶液對草甘膦降解酶紅外吸收的影響相差不大。與不含NaCl溶液的草甘膦降解酶相比，2種濃度NaCl溶液條件下的草甘膦降解酶在2686.77cm-1、2595.43cm-1、2119.96cm-1、881.78cm-1處的特征吸收峰消失，以及在3193.11cm-1、2977.45cm-1和1629.93～1 139.07 cm-1范圍內的特征吸收峰大大削弱。這可能由于高濃度NaCl的存在，造成分子內各部分結構間的排斥作用增強，與蛋白分子中極性基團發生相互作用，從而影響部分化學鍵的伸展方式[28]。

2.3.2 全波段掃描圖譜

草甘膦降解酶溶液經不含NaCl、15%NaCl和20%NaCl溶液處理后進行180～500 nm全波段掃描的紫外吸收圖譜如圖3所示。由圖3可知，不含NaCl的草甘膦降解酶液在波長214 nm處呈現最大吸收強度2.471，而含15%和20%NaCl的草甘膦降解酶溶液在波長205 nm處具有最大吸收強度，與不含NaCl的草甘膦降解酶的吸收強度相比，分別下降為2.085、2.012。在15%NaCl和20%NaCl溶液條件下，草甘膦降解酶的最大吸收波長藍移9 nm，紫外吸收強度明顯有減弱的趨勢，這可能是因為高濃度NaCl溶液改變酶分子所在微環境，影響了草甘膦降解酶分子中的生色基團或共軛體系等分子結構，從而使草甘膦降解酶的紫外吸收強度減弱，且最大吸收波長λmax伴隨藍移現象。

圖3 鹽溶液對草甘膦降解酶全波段紫外吸收圖譜的影響Fig.3 Effect of saline solution on the full band ultraviolet absorption spectrometry of glyphosate degradation enzyme

2.3.3 圓二色譜分析

β-折疊結構相對明確而穩定，而α-螺旋、β-轉角和無規則卷曲相對開放、靈活[29]。

表2 鹽溶液對草甘膦降解酶二級結構的影響Table 2 Effect of saline solution on the secondary structure of glyphosate degradation enzyme

由表2可知，不含NaCl溶液的草甘膦降解酶二級結構中β-折疊結構比例最高，說明未經高鹽處理的草甘膦降解酶結構較為有序。與不含NaCl溶液的草甘膦降解酶二級結構相比，含15%NaCl的草甘膦降解酶分子中α-螺旋比例從19.1%上升至33%，β-折疊比例從39%降低至23.5%，說明經15%NaCl溶液處理后的草甘膦降解酶結構由有序向無序轉變，草甘膦降解酶結構變得松散、不穩定，草甘膦降解酶分子整體結構更加靈活；另外兩種構象所占比例變化相對較小；與含15%NaCl溶液的草甘膦降解酶分子相比，含20%NaCl的草甘膦降解酶分子中無規則卷曲比例迅速增加，由26.1%增加至40.1%，β-折疊比例由23.5%進一步降低至16.8%，α-螺旋比例由33%下降至25.8%，β-轉角所占比例無明顯變化。這說明高濃度NaCl會誘導β-折疊先向α-螺旋，再向無規則卷曲轉化。這也許是由于高濃度NaCl的存在，對草甘膦降解酶分子的側鏈影響較大，增加了草甘膦降解酶蛋白質二級結構各部分間的離子作用，增加了分子結構的無規則卷曲，而無規則卷曲這類有序的非重復性結構經常構成酶活性部位和其他蛋白質特異的功能部位。綜上所述，含20%NaCl的溶液比含15%NaCl的溶液更加有可能對草甘膦降解酶酶活產生影響。

2.3.4 熒光光譜分析

天然蛋白質中只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有熒光性，這3種氨基酸殘基由于側鏈芳香族基團不同而有不同的熒光光譜。由于色氨酸殘基熒光量子產率較酪氨酸和苯丙氨酸高，熒光光譜主要顯示色氨酸殘基的熒光性[30]。

圖4 鹽溶液對草甘膦降解酶熒光光譜的影響Fig.4 Effect of saline solution on fluorescence intensity spectrometry of glyphosate degradation enzyme

由圖4可知，與不含NaCl溶液的草甘膦降解酶的熒光圖譜相比，含有15%和20%NaCl溶液的草甘膦降解酶最大熒光波長λmax從352.8 nm藍移到350.0 nm，與不含NaCl溶液的草甘膦降解酶最大熒光強度（250.1）相比，分別增大到272.4和265.8。通常而言，最大熒光波長與蛋白質分子中色氨酸殘基的位置有關[31]。15%和20%NaCl溶液處理的草甘膦降解酶最大熒光波長λmax從352.8 nm藍移到350.0 nm，表明草甘膦降解酶分子中部分色氨酸殘基在高鹽環境中發生了掩埋。熒光強度增強說明NaCl會誘導草甘膦降解酶結構發生一定程度改變[32]，暴露出部分發色基團，減弱了芳香族氨基酸的親水作用或熒光淬滅相關的作用。隨著鹽濃度從15%增至20%，熒光強度繼續減弱，表明鹽濃度過高會提高蛋白質脫水程度，減弱了與色氨酸等構象相關的相互作用力，其三級結構發生一定程度變化[32]。

3 結論

本研究對具有降解草甘膦能力的米曲霉（Aspergillus oryzae）FUJX 001進行液態發酵培養，收集菌絲體，經液氮研磨，獲得的粗酶液經硫酸銨沉淀初步分離后，再經過Sephadex G-150、Sephadex G-50和DEAE-Sephadex A-50三級柱層析純化后，酶活回收率達36.21%，純化倍數達2.76倍。所獲草甘膦降解酶的分子質量約為34.7 kDa。結果表明，與不含NaCl溶液的草甘膦降解酶相比，含15%和20%NaCl溶液的草甘膦降解酶部分特征吸收峰大大削弱和消失；紫外吸收強度減弱，吸收波長藍移；α-螺旋比例上升，β-折疊比例降低，無規則卷曲比例增加；最大熒光強度增強且伴隨微弱的藍移。草甘膦降解酶分子在高濃度NaCl下，影響酶分子所在的微環境，引入較高濃度離子，與蛋白分子中極性基團發生相互作用，同時引起蛋白質脫水，導致其蛋白質二、三級結構均發生一定變化。為進一步研究草甘膦降解酶在高鹽狀態下如何與底物結合、蛋白結構與酶活變化的關系等提供基礎，同時為草甘膦降解酶在含15%～20%NaCl溶液醬油發酵條件下，如何發揮降解草甘膦能力，消除轉基因大豆中殘留草甘膦提供一定理論依據。

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