響應(yīng)面法優(yōu)化無(wú)花果葉總黃酮超聲輔助提取工藝

馬金菊，孫江飛，武文浩，高峰青*

（1.黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院 環(huán)境與化學(xué)工程系，河南 開封 475004；2.開封市綠色涂層材料重點(diǎn)試驗(yàn)室，河南 開封 475004；3.國(guó)家安全生產(chǎn)監(jiān)督管理總局培訓(xùn)中心，北京 100012）

無(wú)花果（Ficuscarica）葉為桑科植物無(wú)花果的葉，分布在我國(guó)中部、西北部、南部諸省，其具有極高的藥用價(jià)值。無(wú)花果葉中含有糖類、黃酮、果膠和維生素等有效化學(xué)物質(zhì)，具有抗腫瘤、降血脂、降血糖、抗菌、抗病毒等功效[1-3]。

黃酮提取方法有很多種，目前比較常見的有浸提法、雙水相提取法、半仿生提取法、大孔樹脂吸附法、超聲提取法等。浸提法較為成熟，但效率低，提取緩慢，所需溶劑量過(guò)多[4-5]；雙水相提取法分相快，易操作，提取率高，但其消耗成本大[6]；半仿生提取法生產(chǎn)周期短，降低成本，但易引起成分變化[7]；大孔樹脂吸附法吸附速度快，選擇性好，但操作復(fù)雜，工藝要求較高[8-11]；超聲提取法速度快，提取效率高，溶劑使用量少[12-15]。因此本試驗(yàn)利用超聲輔助法探討無(wú)花果葉中總黃酮的提取工藝，將單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化法相結(jié)合，以建立一種高效、清潔、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)花果葉：河南開封市近郊；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：中國(guó)藥品生物制品鑒定所本試驗(yàn)所；無(wú)水乙醇（分析純）：安徽安特食品股份有限公司；亞硝酸鋁（分析純）：焦作市化工三廠；氫氧化鈉、硝酸鋁（分析純）：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；2,2'-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）、Tris-HCl、鄰苯三酚（均為分析純）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；HCl（分析純）：洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；KQ-100E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水真空泵：河南智誠(chéng)科技發(fā)展有限公司；FA2004N電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；101-1A電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲輔助提取

將無(wú)花果葉洗凈、烘干、破碎并過(guò)篩，置于棕色瓶備用。取一定量的樣品，加入相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇，攪拌并靜置15 min，在不同功率下，選擇不同的提取時(shí)間，制得待測(cè)樣品液。對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行多次平行，取算術(shù)平均值[16]。

1.3.2 無(wú)花果葉總黃酮提取率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.020 0 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，配制成質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。移液管移取0、2.50 mL、5.00 mL、7.50 mL、10.00 mL、12.50 mL、15.00 mL此溶液于25 mL容量瓶中，依次加入5%NaNO2溶液1.00 mL、10%Al（NO3）3溶液1.00 mL和4%NaOH溶液10.00 mL，每次加入試劑后均搖勻靜置5min，接著定容至25mL容量瓶中，搖勻并靜置15min。質(zhì)量濃度依次為0、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL、0.12 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，于波長(zhǎng)505 nm處測(cè)定吸光度值[17]。

1.3.3 無(wú)花果葉中總黃酮提取率的計(jì)算

總黃酮提取率計(jì)算公式如下：

式中：Y為樣品中總黃酮提取率，mg/g；C為無(wú)花果葉中黃酮類化合物的質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為稀釋體積，mL；V2為樣品溶液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，mg；V3為取樣體積，mL。

1.3.4 總黃酮提取條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

分別以液料比、超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度為影響因素，設(shè)置4個(gè)因素的不同水平，分析不同提取條件對(duì)無(wú)花果葉中總黃酮提取率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Benhnken Design（BBD）法設(shè)計(jì)4因素3水平的試驗(yàn)，因素按照順序分別是：液料比（A）、超聲時(shí)間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）、超聲提取溫度（D）；-1、0、1（代表每個(gè)自變量的低、中、高水平）；無(wú)花果葉中總黃酮的提取率（Y）作為響應(yīng)值，因素與水平編碼見表1。

表1 總黃酮提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for total flavonoids extraction conditions optimization

1.3.6 抗氧化活性測(cè)定

以ABTS自由基和超氧陰離子自由基的清除率來(lái)考察無(wú)花果葉中總黃酮的抗氧化性。

（1）ABTS自由基的清除

參照韓光亮等[18]的方法，以分光光度法測(cè)定ABTS自由基清除率。取不同體積分?jǐn)?shù)樣品液2.00 mL，與8.00 mL ABTS使用液混合，混勻，置于暗處30min，以蒸餾水作參比，于波長(zhǎng)517nm處測(cè)定吸光度值。ABTS自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：A0為樣品液和ABTS+溶液吸光度值；A1為ABTS+溶液吸光度值；A2為不含ABTS+溶液時(shí)樣品液吸光度值。

（2）超氧陰離子自由基的清除

參照李加興等[19]的方法，以分光光度法測(cè)定超氧陰離子自由基清除率。取不同體積分?jǐn)?shù)樣品液1.00 mL，各加入4.50 mLTris-HCl緩沖液和0.10 mL鄰苯三酚，反應(yīng)5 min后加入1.00 mLHCl溶液終止反應(yīng)，混勻，以蒸餾水作參比，于波長(zhǎng)299 nm處測(cè)定吸光度值。超氧陰離子自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：A1為樣品液和含鄰苯三酚溶液吸光度值；A2為不含鄰苯三酚溶液樣品液吸光度值；A3為含鄰苯三酚溶液吸光度值。

（3）數(shù)據(jù)處理

參照王彥平等[18-19]的方法，采用Origin7.5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)制圖，分析單因素試驗(yàn)結(jié)果；使用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面結(jié)果分析和圖形輸出。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。由圖1可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=9.267 9X+0.008 9，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 3。表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線在0～0.10 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 液料比對(duì)無(wú)花果葉總黃酮提取率的影響

由圖2可知，液料比＜30∶1（mL∶g）時(shí)和總黃酮提取率關(guān)系呈現(xiàn)為正相關(guān)，之后呈現(xiàn)為負(fù)相關(guān)。液料比在30∶1（mL∶g）時(shí)，總黃酮提取率最大。推測(cè)其原因可能是水加入使樣品充分溶脹，使樣品和溶劑的接觸面積增加，導(dǎo)致了總黃酮的提取率也增加。因此，液料比確定為30∶1（mL∶g）。

圖2 液料比對(duì)無(wú)花果葉總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of total flavonoids from Ficus carica leaves

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)無(wú)花果葉總黃酮提取率的影響

圖3 超聲時(shí)間對(duì)無(wú)花果葉總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasound extraction time on the extraction rate of total flavonoids from Ficus carica leaves

由圖3可知，總黃酮提取率隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)為正相關(guān)，超聲提取時(shí)間25min時(shí)總黃酮提取率最大，超聲時(shí)間25 min后呈現(xiàn)為負(fù)相關(guān)。由于超聲時(shí)間較長(zhǎng)，可能導(dǎo)致乙醇揮發(fā)較快，導(dǎo)致提取率下降。因此，超聲時(shí)間確定為25 min。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)無(wú)花果葉總黃酮提取率的影響

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)無(wú)花果葉總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids from Ficus carica leaves

由圖4可知，總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)為正相關(guān)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)最高，總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而呈現(xiàn)為負(fù)相關(guān)，推測(cè)是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)較高時(shí)，一些原料中其他物質(zhì)也被乙醇溶解從而影響試驗(yàn)效果，因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)確定為70%。

2.1.4 超聲溫度對(duì)無(wú)花果葉總黃酮提取率的影響

由圖5可知，當(dāng)超聲溫度＜70℃時(shí)提取率呈現(xiàn)為正相關(guān)，之后呈現(xiàn)為負(fù)相關(guān)，推測(cè)可能是乙醇揮發(fā)較快，無(wú)花果葉中黃酮物質(zhì)不能充分被溶解，因此，超聲溫度選擇70℃。

圖5 超聲溫度對(duì)無(wú)花果葉總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasound extraction temperature on extraction rate of total flavonoids from Ficus carica leaves

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)原理和表因素編碼表，無(wú)花果葉中黃酮的提取率（Y）為響應(yīng)值，使用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行結(jié)果分析。具體響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析結(jié)果如表2所示。

表2 總黃酮提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology for total flavonoids extraction conditions optimization

續(xù)表

2.2.2 模型的建立及方差分析[20-21]

采用Design-Expert8.0.6軟件將試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和方差分析，結(jié)果見表3。經(jīng)回歸擬合后，由響應(yīng)面分析法得出關(guān)于超聲輔助法提取總黃酮得率的二次回歸擬合方程：

表3 多元回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of multiple regression model

由表3可知，失擬項(xiàng)F值=28.65，P＞0.05說(shuō)明相對(duì)于純誤差失擬不顯著。獲得回歸模型線性回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.966 3，說(shuō)明96.63%響應(yīng)值的變化是由獨(dú)立變量決定。此外，模型變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=0.87%，證明該試驗(yàn)值精密度及可靠性可以用。因此，該模型總體擬合具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，無(wú)花果葉中總黃酮提取最佳工藝可以用此方案預(yù)測(cè)。根據(jù)F值的大小，推測(cè)出本試驗(yàn)幾個(gè)影響因素的重要性為超聲時(shí)間（B）＞超聲溫度（D）＞液料比（A）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）。

2.2.3 響應(yīng)面分析

圖6 超聲溫度、超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)及液料比的交互作用對(duì)無(wú)花果葉總黃酮提取率影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between ultrasound temperature,time,ethanol concentration and liquid-solid ratio on the extraction rate of total flavonoids from Ficus carica leaves

用Design-Expert8.0.6軟件繪制以黃酮提取率為響應(yīng)值的各因子交互作用的響應(yīng)曲面圖，發(fā)現(xiàn)超聲溫度與液料比、超聲溫度與超聲時(shí)間兩組交互性相對(duì)較弱。而超聲溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比、超聲時(shí)間與液料比四組交互性較強(qiáng)，結(jié)果見圖6。

由圖6A可知，提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%時(shí)達(dá)到最大值，而后開始下降。超聲溫度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。等高線呈橢圓形，說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲溫度的交互影響較為顯著。由圖6B可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，提取率也呈增加趨勢(shì)，且在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%時(shí)達(dá)到最高值，然后下降。超聲時(shí)間也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。由圖6C可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，提取率也呈先上升后下降的趨勢(shì)。液料比的變化趨勢(shì)也與之相似。說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間、液料比的影響較大，表現(xiàn)為曲線更為陡峭。等高線呈扁橢圓型趨勢(shì)。由圖6D可知，隨著超聲時(shí)間的增加，提取率隨液料比的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，表明超聲時(shí)間與液料比對(duì)試驗(yàn)的影響最大，等高線呈更為扁平的橢圓形，表明超聲時(shí)間與液料比的交互作用最為顯著，因此曲線最為陡峭。由此可見，超聲時(shí)間與液料比的交互作用最為顯著。

2.3 最優(yōu)工藝及驗(yàn)證試驗(yàn)

分析回歸模型，得出最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70.25%，液料比29.88∶1（mL∶g），超聲時(shí)間25.23 min，超聲溫度69.52℃模型預(yù)測(cè)總黃酮提取率為27.384 mg/g。優(yōu)化模擬結(jié)果，得到最佳工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，液料比30∶1（mL∶g），超聲時(shí)間25 min，超聲溫度70 ℃，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到總黃酮提取率平均值為27.379 mg/g。與模型預(yù)測(cè)值基本一致，說(shuō)明所得模型可以用來(lái)預(yù)測(cè)無(wú)花果葉中總黃酮提取率。

2.4 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 對(duì)ABTS自由基的清除

考察無(wú)花果葉中總黃酮對(duì)ABTS自由基的去除能力，當(dāng)提取液質(zhì)量濃度在10.00 mg/mL時(shí)自由基的去除率達(dá)到最高65.23%，也證明了無(wú)花果葉黃酮類物質(zhì)具有較好的抗氧化性。

2.4.2 對(duì)超氧陰離子自由基的清除

考察無(wú)花果葉中總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的去除能力，當(dāng)提取液質(zhì)量濃度為4.00 mg/mL時(shí)自由基的去除率達(dá)到最高73.21%，也證明了無(wú)花果葉黃酮類物質(zhì)具有較好的抗氧化性。

3 結(jié)論

經(jīng)Design-Expert8.0.6優(yōu)化，檢驗(yàn)確定最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，液料比30∶1（mL∶g），超聲時(shí)間25 min，超聲溫度70℃，模型預(yù)測(cè)總黃酮提取率為27.384mg/g。依據(jù)響應(yīng)面要求優(yōu)化后總黃酮提取率算數(shù)平均值為27.379mg/g，二者一致性較好，說(shuō)明所得模型可以用于無(wú)花果葉黃酮提取工藝的優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)無(wú)花果葉中黃酮提取液對(duì)ABTS自由基清除率最高65.23%，對(duì)超氧陰離子自由基清除率最高73.21%，證明該提取物具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

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