HPLC-ELSD法同時測定酵母發酵液中的多元醇

王曉丹，白曉燕，朱國軍，雷安亮，陳美竹，邱樹毅*

（1.貴州大學 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州珍酒釀酒有限公司，貴州 遵義 563000）

絕大多數白酒均呈甜味，甜味是一種讓人感覺比較愉悅的口感，尤其在酒精度高的白酒中，微甜味可以使酒體更加綿柔醇厚。這種甜味主要來自于醇類[1]。多元醇是酒醅中的酵母菌在生成酒精的同時通過發酵還原糖所產生的，在酒中可起緩沖作用，使白酒更加豐滿醇厚[1-2]。白酒中的多元醇種類繁多，主要包括丙三醇、阿拉伯糖醇、核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇、甘露醇、半乳糖醇、麥芽糖醇等，甜度隨羥基數增多而增強[2]。由于多元醇沸點高，屬于難揮發性醇類，不易隨蒸餾進入酒中，在蒸餾酒醅時，一小部分多元醇會隨著水蒸氣被帶入酒中，因此白酒中多元醇含量極低，定量分析的難度較大[3]。

目前，白酒中多元醇的檢測方法主要有：薄層層析法、高效液相色譜-蒸發光散射檢測器（high performance liquid chromatography-evaporativelight-scattering detector，HPLCELSD）[4]、液質聯用法[5]、毛細管氣相色譜法[6]、離子色譜積分脈沖安培法[7-8]等。氣相色譜法由于其高分辨率、高靈敏度、低檢測限等優點而被廣泛使用。但多元醇具有高極性、強親水性以及低揮發性的特性，氣相色譜法測定時，必須將糖醇衍生化為易揮發且穩定的衍生物，操作繁瑣而復雜，容易帶來誤差[9]。離子色譜法雖然靈敏度較好，但是受環境溫度的影響大，且由于糖類在電極表面能將某些分子氧化或還原，因而該方法準確性受限[10]。高效液相色譜-蒸發光散射法具有基線穩定、分離效果良好，結果準確、樣品處理簡單、測定速度快等優點，因此在本研究中選用高效液相色譜-蒸發光散射法對酵母發酵液中多元醇進行測定。

由于白酒釀造中，多元醇不易隨蒸餾進入酒中，本研究建立一種高效液相色譜-蒸發光散射法對酵母菌發酵液中多元醇種類及含量進行測定，以課題組前期從醬香型大曲和酒醅中分離的酵母菌株為研究對象，測定酵母菌產多元醇類物質的能力。以期找到在白酒釀造中對多元醇產生能力較強的酵母菌，為后期白酒中多元醇的提高奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絲孢酵母（Trichosporon coremiiforme）（FBKL2.0118、FBKL2.0307、FBKL2.0315）、婁德酵母（Lodderomyceselongisporus）FBKL2.00130、庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）FBKL2.0310分離篩選于醬香型大曲和酒醅中并保藏于貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室。

D-阿拉伯糖醇（純度≥98%）、D-核糖醇（純度≥98%）、赤蘚糖醇（純度≥99%）：上海源葉生物科技有限公司；木糖醇（純度≥99.5%）、山梨糖醇（純度≥98%）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

酵母膏胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dxtrose，YEPD）培養基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

酵母種子培養基：葡萄糖20 g，酵母粉10g，蛋白胨20 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

酵母發酵培養基：葡萄糖200 g，酵母粉10 g，蛋白胨20 g，蒸餾水1 000 mL，115℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

Milli-Q Academic密理博超純水儀：密理博（上海）貿易有限公司；Agilent1260高效液相色譜儀、Agilent G4260B蒸發光散射檢測器、SPEC18固相萃取小柱（200 mg，3 mL）、Agilent Hi-plexCa液相色譜柱（7.7 mm×300 mm，8μm）：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

精確稱取D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇及山梨糖醇標準品0.01 g于10 mL容量瓶中，用二次蒸餾水分別配制成質量濃度為1.0 mg/mL的標準儲備溶液，并用0.22μm微孔濾膜過濾。準確稱取D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇及山梨糖醇標準品各0.500 0 g于50 mL容量瓶中，配制成質量濃度為10.0 mg/mL的多元醇混合標準品儲備溶液，用蒸餾水稀釋成質量濃度分別為8.0 mg/mL、6.0 mg/mL、4.0 mg/mL、2.0 mg/mL、1.0 mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL的混合標準工作液，并用0.22μm微孔濾膜過濾。

1.3.2 樣品處理

大數據常用的數據分析處理技術包括云計算和Mapreduce系統、數據庫、可視化技術等。云計算是大數據分析處理技術的核心原理，也是大數據分析應用的基礎平臺。Mapreduce系統提出簡化了數據的計算過程，避免了大量數據傳輸。數據庫則是為用戶提供了各種數據以及獲取數據的方式，可視化技術即運用計算機圖形學和圖像處理技術，將分析出來的數據轉換為圖形或圖像形式，與用戶進行交互處理。這一技術極大地方便了通過數據及時掌握生產的內在變化[1]。隨著數據處理軟件的不斷更新升級，越來越多的多樣化功能軟件將被應用在工業生產的大數據動態分析中，自動為用戶展現最直觀的結果。

參照白小燕等[11]的方法，將酵母菌株經YEPD培養基活化后接種到酵母種子培養基中，在30℃、160 r/min條件下擴大培養24 h即為種子培養液，種子培養液按照5%的接種比例接種到裝液量為50 mL/250 mL的酵母發酵培養基中，30℃、160 r/min搖瓶培養5 d后獲得發酵液。

吸取5 mL發酵液于試管中，65℃水浴10 min后轉移到離心管中，10 000 r/min離心10 min，獲得上清液并經C18固相萃取小柱凈化，再用0.22μm水系濾膜過濾后，待高效液相色譜儀分析。

1.3.3 高效液相色譜條件

色譜條件：Agilent Hi-plexCa色譜柱（7.7 mm×300 mm，8 μm）；流動相：純水；流速：0.5 mL/min；柱溫：70℃；進樣量：4μL；檢測器：蒸發光散射檢測器（ELSD）；霧化溫度為60℃；蒸發溫度為60℃；增益：2；氮氣（純度為99.999%）為載氣。采用5種多元醇標準品的色譜峰保留時間對發酵液中多元醇進行定性；用外標法進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 5種多元醇標準品及樣品高效液相色譜檢測結果

由圖1可知，HPLC-EISP法可以檢測到酵母發酵體系中的主要成分葡萄糖和甘油，同時還可以測到D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇和山梨醇這五種多元醇，因此說明此方法能夠準確分析酵母發酵多元醇的代謝成分的變化。從多元醇標準品得到各多元醇的保留時間為：葡萄糖13.329 min，D-核糖醇16.869 min，赤蘚糖醇19.568 min，甘油20.349，D-阿拉伯糖醇23.143 min；木糖醇28.103 min，山梨醇29.223 min。將酵母發酵液和多元醇標準品對比可得，酵母FBKL2.0118發酵液中含有D-核糖醇和D-阿拉伯糖醇；酵母FBKL2.0315發酵液中含有赤蘚糖醇；酵母FBKL2.0310發酵液中含有甘油、D-阿拉伯糖醇、木糖醇和山梨醇，且由于殘糖量過高，葡萄糖已經超出檢測限，出現平頭峰；酵母FBKL2.0073發酵液中含有D-阿拉伯糖醇；酵母FBKL2.0307發酵液中含有D-阿拉伯糖醇和山梨醇。進一步優化D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇和山梨醇五種多元醇檢測方法。

2.2 回歸方程、線性范圍和檢出限

配制不同質量濃度的5種多元醇混合標準溶液，在相同試驗條件下進行測試分析，根據測得的峰面積（Y）和相對應的多元醇質量濃度（X）進行線性回歸，得到5種多元醇標準品的線性回歸方程和相關系數R；以信噪比等于3（S/N=3）為標準[12]，得到5種多元醇的檢出限，結果如表1所示。由表1可知，5種多元醇的相關系數R在0.996～0.999之間，表明在各自線性范圍內5種多元醇的質量濃度與峰面積均具有良好的線性關系。5種多元醇檢出限在0.045～0.058mg/mL之間，表明該方法能夠實現多元醇含量的測定。

表1 5種多元醇標準品的回歸方程、線性范圍及檢出限Table 1 Regression equation,linear range and limit of detection of 5 polyhydric alcohols

2.3 精密度實驗

表2 精密度實驗結果Table 2 Results of precision tests

采用HPLC-ELSD法對5種多元醇的混合標準工作溶液（1.0 mg/mL）平行測定6次，記錄色譜峰面積，計算相對標準偏差（relativestandard deviation，RSD），判斷該檢測方法的精密度[13-15]，結果如表2所示。由表2可知，5種多元醇含量檢測結果的相對標準偏差（RSD）均在1.22%～4.53%之間，說明該實驗方法精密度良好。

2.4 方法的回收率試驗

用菌株FBKL2.0310制備相同酵母發酵液2份，其中一份發酵液作為本底，另一份發酵液添加一定量的5種多元醇溶液進行加標回收率試驗，設置3個水平，每個水平重復進樣6次，采用HPLC-ELSD法進行檢測，計算回收率和RSD值[16-17]，結果如表3所示。由表3可知，5種多元醇的平均回收率在96.73%～100.46%之間，RSD值為0.22%～3.31%，說明該方法準確度較高，可以用于實際酵母發酵液的檢測。

表3 樣品加標回收率試驗結果Table 3 Results of samples adding standard recovery rates tests

2.5 穩定性和重現性試驗

取5種多元醇的混合標準工作溶液（1.0 mg/mL），放置于4 ℃冰箱中，分別于0、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h時取樣，進行多元醇含量測定，測得標品中D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇的峰面積相對標準偏差（RSD）（n=6）分別為2.28%、1.75%、1.99%、1.88%、2.84%和2.10%。表明該方法對于5種多元醇在24 h內測定穩定性較好。

按樣品發酵液制備方法平行操作，取菌株FBKL2.0310制備的發酵液6份，平行進樣3次，測得發酵液中D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇的峰面積相對標準偏差（RSD）分別為1.03%、1.36%、0.40%、1.87%和0.37%，表明本方法重現性良好。

2.6 酵母菌株發酵液中多元醇定量分析

本課題組前期從醬香型大曲和酒醅中篩選到利用葡萄糖產生糖醇能力較強的酵母菌株FBKL2.0130、FBKL2.0118、FBKL2.0307、FBKL2.0310、FBKL2.0315，并以這5株酵母菌作為發酵菌株，接種到發酵培養基中于30℃、160 r/min搖瓶培養5 d得到發酵液，利用高效液相色譜-蒸發光散射檢測器法對5株酵母發酵液中多元醇進行測定，將測得各多元醇峰面積代入相應的回歸方程得到各多元醇的含量，定量結果如表4所示。由表4可知，菌株FBKL2.0130產D-阿拉伯糖醇能力最強（12.05 g/L），并且產多元醇總量最多（13.03 g/L）；菌株FBKL2.0118產D-核糖醇和D-阿拉伯糖醇；菌株FBKL2.0307產D-阿拉伯糖醇和山梨糖醇；菌株FBKL2.0310能夠產D-阿拉伯糖醇、木糖醇和山梨糖醇，菌株FBKL2.0315僅可以產赤蘚糖醇。

表4 不同酵母發酵液中多元醇含量Table 4 Polyhydric alcohols contents in different yeast fermentation broth

3 結論

本實驗建立了高效液相色譜-蒸發光散射（HPLC-ELSD）同時檢測酵母發酵液中D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇的方法。結果表明，5種多元醇在0.8～6.0 mg/mL質量濃度范圍內與色譜峰面積呈良好的線性關系（相關系數R均≥0.996）；精密度實驗結果相對標準偏差（RSD）均＜5%，回收率為96.73%～100.46%，重現性和樣品在24 h內穩定性的RSD均＜1.90%，表明該方法具有良好的準確性、重現性和穩定性。菌株FBKL2.0130產D-阿拉伯糖醇能力最強（12.05g/L）；且產多元醇總量最多（13.03g/L）。

本實驗以醬香型白酒釀造過程中大曲和酒醅分離的酵母為研究對象，運用本方法能夠在30 min內同時測定到酵母發酵液中的D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇，為白酒的風格特征的凸顯和品質的保證提供了科學依據和保證。

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