釀造食醋中碳、氧同位素比值的測定及應用研究

王 奇，劉鐘棟*，熊 岑，肖偉敏，張協光，楊國武

（1.河南工業大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001；2.深圳市計量質量檢測研究院，廣東 深圳 518000；3.廣東石油化工學院環境與生物工程學院，廣東 茂名 525000）

食醋在中國歷史悠久，醋的使用能改善食物的風味。食醋按照生產方法可以分為釀造食醋和配制食醋[1-2]。在中國，有很多糧食作物都可以用來釀造食醋，如小麥、高粱和大米等[3]，根據原料的不同又可劃分為米醋、陳醋和酒醋等[4-5]。不同產地的食醋會因生產原料和加工工藝的差異，使得各自獨具特色風味。目前市面上銷量較廣的屬山西老陳醋、鎮江香醋和鎮江陳醋，還有部分米醋、白醋及其他種類的食醋。

近年來，食品摻假現象頻頻發生。山西老陳醋、鎮江香醋和鎮江陳醋屬于地理標志產品[6-7]，在利益的驅使下，不法分子以廉價劣質醋來冒充這些名優食醋。目前針對食醋真偽的檢測尚且沒有確切的檢測方法，不少學者也對食醋中的有效成分進行了研究，如氨基酸[8]、有機酸[9]以及礦物元素[10]等，但結果并不理想。穩定同位素質譜技術已在食品摻假和溯源研究上展現出巨大的作用，如酒類的鑒定[11-12]、肉的產地分析[13]以及地理標志產品武夷巖茶的產地識別[14]等。課題組先前報道了同位素質譜技術在食醋上的應用[15]，本實驗立足新技術深入研究，以地理標志產品山西老陳醋、鎮江香醋和鎮江陳醋為研究對象，研究建立元素分析-同位素比質譜法（elemental analysis-isotoperatio massspectrometry，EA-IRMS）和連續流-穩定同位素比質譜法（GasBenchⅡ-IRMS）對食醋中碳、氧同位素比值的測定方法，以期為食醋的真實性鑒別提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山西老陳醋、鎮江香醋和鎮江陳醋（均帶有地理標志），每種10個，共計30個：市售。氦氣（He）（純度99.999%）、0.3%CO2和He混合氣：深圳市云飛龍特種氣體有限公司；CO2氣（純度99.999%，標準參考氣）：中國標準物質中心；同位素標準物質尿素（δ13CV-PDB=-37.32±0.04‰）：德國IVA Analysentechik公司；同位素標準物質谷氨酸（δ13CVPDBLSVEC=-26.39±0.04‰）：美國地質調查局；氫氧同位素水標準物質：中國地質科學院水文地質環境地質研究所。

1.2 儀器與設備

Flash 2000元素分析儀、GasBenchⅡ連續流前處理裝置、Delta V Advantage穩定同位素比質譜儀、錫杯（8 mm×5 mm）：美國賽默飛世爾科技公司；Milli-Q超純水處理系統：德國Milipore公司；XP6百萬分之一天平：瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 EA-IRMS和GasBenchⅡ-IRMS工作原理

EA-IRMS工作原理：樣品經錫囊包裹后，通過固體自動進樣器，被He氣載入到動態快速燃燒石英管中，氧化石英管自上而下依次為氧化劑Cr2O3，還原劑Cu和脫鹵去硫劑Ag2Co3O4。在純氧脈沖和980℃的高溫條件下，試樣中的有機碳全部轉化為CO2，銅粒能夠還原氮氧化物，排除與CO2相同質量分數N2O的影響。除水阱能夠除去多余的水分。CO2經GC柱分離開來，由ConFlo IV裝置的Open Split接口導入到IRMS中，測定CO2的碳同位素比值（δ13C），相當于原試樣中有機碳的δ13C值。

GasBenchⅡ-IRMS工作原理：即CO2-H2O平衡法。樣品注入到樣品瓶中，通過充氣針向進樣瓶中充入0.3%CO2和He混合氣，使得混合氣和樣品在室溫條件下完成平衡。此時H2O比CO2更能富集氧同位素，水的分子數遠遠大于CO2的分子數，而H2O中極少量的18O會轉移至CO2中，所以使得CO2中的18O/16O與H2O中的18O/16O達到同位素平衡狀態，平衡過后測定CO2的氧同位素比值（δ18O），相當于測定原來H2O中的δ18O值。

1.3.2 實驗方法

元素分析（EA）：移取離心后的食醋樣品2 mL左右于10 mL離心管中，加入2 mL去離子水，渦旋混勻，用于食醋總碳δ13C值測定。用移液槍移取1μL上清液至錫杯中，每個樣品平行測定3次，取平均值。

連續流（GasBenchⅡ）：將離心后的食醋樣品經0.22μm的濾膜過濾后，移取500μL至反應瓶中，等待充氣平衡，每個樣品平行測定2次，取平均值。

1.3.3 檢測條件

元素分析儀條件：氧化還原管溫度：980℃；柱溫：50℃；載氣He流速：100 mL/min；O2流速：175 mL/min。

GasBenchⅡ條件：樣品盤溫度：27℃；柱溫：70℃；載氣He壓力：1 bar；CO2壓力：1.3 bar；混合氣壓力：3 bar。

同位素比質譜法（IRMS）條件：離子化方式：電子轟擊離子源（electron ionization，EI）；掃描方式：正離子掃描；離子源電壓：3.06 kV；EA條件下的真空度：1.3×10-6mbar，GasBench Ⅱ條件下的真空度：8.5×10-7mbar。

1.3.4 碳、氧同位素比值計算方法

IRMS測定的是同位素比值δ，即樣品中某一元素的重同位素原子豐度與輕同位素原子豐度之比（如碳同位素比13C/12C）與標準物質同位素比值比較計算得到。δ13C值、δ18O值計算公式如下：

1.3.5 數據處理

實驗所得數據由軟件Isodat3.0計算得出。數據由Origin 8.0和SPSS20.0進行分析和處理。

2 結果與分析

2.1 食醋總碳δ13C值測定稀釋倍數和進樣體積的優化探究

從預實驗中發現，食醋樣品如果不稀釋直接移取上機，信號強度會比CO2參考氣高出許多。該方法測定δ13C時，需使樣品的信號強度與標準氣體CO2的信號強度盡量保持一致，δ13C測定值才會更準確。所以應對食醋稀釋倍數和進樣體積進行優化。EA的液體進樣體積一般在1～2μL，進樣體積過大時，因樣品中含有過多水分容易造成其在氧化爐中燃燒不充分，這不但會影響到樣品的信號強度和測定結果；長時間積累后還會造成石英管堵塞，浪費氧化還原試劑，并縮短石英管壽命。本實驗中先將進樣體積控制在1.0μL，通過優化食醋稀釋倍數來探究食醋進樣濃度對檢測結果的影響。將離心后的食醋樣品分別稀釋1倍、2倍、5倍、10倍和100倍，采用EA-IRMS法進行檢測，結果見圖1。

由圖1A可知，三種不同食醋CO2信號強度隨著食醋稀釋倍數的增加而降低，這可能是由于食醋濃度的降低，導致進入質譜的CO2分子總量減少，造成信號值變小。當食醋稀釋到10倍時，兩種食醋的CO2信號強度降至1 000 mV以下，此時信號值過低，從數據的精密度上反映出此時的結果不準確；由圖1B可知，δ13C值隨著食醋稀釋倍數的增加先是穩定在一定范圍，當稀釋倍數＞5時，δ13C值發生了明顯浮動，這可能是因為樣品內水分含量過高導致燃燒不完全。因此，選擇食醋稀釋倍數為2倍。

圖1 不同稀釋倍數下食醋CO2信號強度（A）和食醋總碳的δ13C值（B）Fig.1 CO2 signal intensity(A)andδ13C values of total carbon(B)of vinegars with different dilution ratios

將稀釋后的食醋樣品的進樣體積設定為0.5μL、1.0μL、1.5 μL、2.0 μL、2.5 μL，每個樣品做3個平行樣，取平均值，結果見圖2。

圖2 不同進樣體積下食醋CO2信號強度（A）和食醋總碳的δ13C值（B）Fig.2 CO2 signal intensity(A)andδ13C values of total carbon(B)of vinegars with different injection volume

由圖2A可知，食醋信號強度隨著進樣體積的增加而增加；圖2B表明隨著食醋進樣體積的增大，食醋總碳δ13C值變化不大，這說明進樣體積的改變沒有對δ13C值的測定造成影響；在長時間進樣后發現，如果液體進樣體積偏大，一方面會浪費反應試劑，另一方面可能因殘留使得樣品之間相互影響。綜合考慮，本實驗選用進樣體積為1.0μL作為實驗條件。

2.2 食醋水中氧檢測條件優化

2.2.1 樣品瓶氣密性分析

本實驗需使混合氣體在密封條件下與水發生平衡氧交換，所以在進行平衡時必須確保儀器和樣品瓶的氣密性。為驗證進樣瓶的氣密性，本實驗將32個空進樣瓶放置于進樣盤中，向瓶中充氣后，每隔1 h進行測定，結果見圖3。由圖3可知，在測定32 h內，氧同位素比值的范圍在1.10‰～1.38‰，標準偏差（standard deviation，SD）為0.08‰，測定結果較為穩定，表明反應瓶氣密性良好。

圖3 反應瓶氣密性檢測結果Fig.3 Gas tightness detection results of reaction bottles

2.2.2 反應平衡時間的選擇

根據GasBench的測定原理，需對食醋的平衡時間進行優化探究，本實驗選取了山西老陳醋、鎮江香醋和鎮江陳醋3種食醋樣品，向樣品瓶中通入混合氣后，每隔2 h進行GasBenchⅡ-IRMS測定，結果見圖4。

圖4 平衡時間對δ18O值的影響Fig.4 Effect of equilibration time on theδ18O values

由圖4可知，隨著平衡時間的增長，3種食醋水的δ18O值均表現為先上升后穩定的趨勢，表明在4～24 h內混合氣與樣品正在發生反應，在24～32 h區間說明反應已經進行完全。王道兵等[16]在測定葡萄酒中水的δ18O值時發現，在24～70 h區間內，δ18O值均保持穩定，這與本研究的結論一致。因此，選取從第24小時開始測定食醋水中氧的δ18O值。

2.2.3 食醋樣品體積選擇

測定食醋水中的氧，樣品均以原濃度上機而不能加入外源水。對不同進樣體積條件下的δ18O值進行探究，選用200μL、500μL、1 000μL、1 500μL不同的進樣體積，采用GasBenchⅡ-IRMS進行測定，結果見表1。由表1可知，在200～1 500μL范圍內，隨著食醋樣品體積的增大，3種食醋水中氧的δ18O值最大極差為0.23，最小為0.08，標準偏差（SD）均＜0.15‰；表明測定值較為穩定，結果之間無顯著差異（P＞0.05）。本實驗選擇樣品體積為500μL作為實驗條件。

表1 樣品體積對δ18O值的影響Table 1 Effect of sample volume onδ18O values

2.3 測定結果的穩定性

為了驗證EA-IRMS和GasBenchⅡ-IRMS方法的穩定性，對三種食醋樣品檢測結果進行穩定性分析，按照優化過的實驗條件進行測定。每次測定時都選用標準物質谷氨酸作為質控樣。每個樣品重復測定5次，計算平均值及SD值，結果見表2。由表2可知，三種食醋樣品碳同位素比測定值SD值均＜0.30‰，氧的同位素比測定值的SD值均＜0.10‰，表明該測定方法的穩定性較好。

表2 δ13C和δ18O值重復性測定結果Table 2 Repeatability determination results ofδ13C and δ18O values

2.4 食醋樣品中碳、氧同位素比測定結果分析

本實驗按照上述方法對30個帶有地理標志，同一產地包含不同品牌的食醋樣品中碳、氧同位素比進行了測定，檢測結果見圖5，食醋總碳δ13C值與水中氧δ18O值聚類分析結果見圖6。

圖5 食醋總碳δ13C值與水中氧δ18O值測定結果Fig.5 Determination results of total carbonδ13C values in vinegars andδ18O values in water

由圖5可知，山西老陳醋總碳的δ13C值在-23.26‰～-20.80‰之間，平均值為-22.01‰；鎮江香醋在-25.93‰～-23.18‰，平均值為-24.55‰；鎮江陳醋在-25.47‰～-20.70‰，平均值為-23.41‰。利用食醋總碳δ13C值進行顯著性分析，可知山西老陳醋與鎮江香醋之間具有極顯著性差異（P＜0.01），表明這兩種食醋可以很好地區分開；山西老陳醋與鎮江陳醋具有顯著性差異（P=0.04＜0.05），經聚類分析后發現仍有交叉重疊。山西老陳醋水中氧的δ18O值在-5.66‰～-4.49‰，鎮江香醋在-7.57‰～-5.68‰，鎮江陳醋在-8.35‰～-5.61‰。就地域而言，山西和鎮江的食醋中氧同位素比具有極顯著差異（P＜0.01）。

圖6 食醋總碳δ13C值與水中氧δ18O值聚類分析結果Fig.6 Cluster analysis results of total carbonδ13C values in vinegars andδ18O values in water

由圖6可知，結合食醋總碳δ13C值進聚類分析，可以得到山西和鎮江食醋各自聚為一類，鎮江陳醋中有只有3個樣本被誤判為山西老陳醋，表明該方法可以應用于食醋的地域區分。

食醋中碳同位素比的差異最可能來自于生產食醋的原料，山西老陳醋的釀造原料有高粱、大麥、豌豆、麩皮等，而鎮江香醋、鎮江陳醋的原料為糯米、麥麩、大米等。山西老陳醋使用的原料大多為C3植物；而鎮江香醋、鎮江陳醋多為C4植物。植物的光合作用可分為C3、C4和景天酸途徑，不同的光合過程造成碳同位素比的差異，C3植物的δ13C值在-22‰～-33‰，C4植物的δ13C值在-10‰～-20‰[17]。水中氧同位素的地域差異，可能是受到水分的蒸發降雨過程的影響[18]，山西和鎮江不同地域的食醋在發酵過程中使用本地區的水，因而表現出了地域性的差異。山西老陳醋、鎮江香醋和鎮江陳醋分別為南北食醋的代表，這種碳氧同位素差異的存在，從而對產地區分提供參考。

3 結論

本實驗建立了EA-IRMS和GasBenchⅡ-IRMS測定食醋中碳氧同位素比的方法。并應用到山西老陳醋、鎮江香醋和鎮江陳醋中碳氧同位素比的測定。食醋總碳δ13C值測定的最佳條件為食醋稀釋2倍，進樣體積為1.0μL；食醋水中氧δ18O值的測定采用CO2-H2O平衡法，從平衡時間的第24小時開始測定。三種食醋樣品碳同位素比測定值SD值均＜0.30‰，氧的同位素比測定值的SD值均＜0.10‰，表明該測定方法的穩定性較好。山西老陳醋總碳的δ13C值在-23.26‰～-20.80‰，水中氧的δ18O值在-5.66‰～-4.49‰之間；鎮江香醋在-25.93‰～-23.18‰，δ18O值在-7.57‰～-5.68‰之間；鎮江陳醋在-25.47‰～-20.70‰，δ18O值在-8.35‰～-5.61‰之間。使用食醋總碳δ13C值可以將山西老陳醋與鎮江香醋區分開，但與鎮江陳醋存在部分重疊（P=0.04）。結合食醋水中氧的δ18O值后，明顯改善了山西和鎮江地域性食醋的區分效果（P＜0.01）。故食醋總碳δ13C值和食醋水中δ18O值均可作為區分食醋產地判別的參考指標之一，未來可繼續研究食醋多組分的同位素比值，力求為釀造食醋與配制食醋的有效鑒別提供新思路新技術。

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