SAS誘導氧化應激時人卵巢癌順鉑敏感細胞與耐藥細胞死亡方式的差異

高瑋男，張雪雙，孫連坤，于春艷*，劉亞男*

(1.吉林大學臨床醫學院，吉林 長春130021；2.北華大學基礎醫學院病理學教研室；3.吉林大學基礎醫學院病理生理學系)

Bcl2抑制劑ABT737能夠誘導SKOV3/DDP細胞發生凋亡，但不能完全抑制SKOV3/DDP 細胞增殖[1]，提示耐藥細胞不僅存在凋亡逃逸，還有可能存在其他形式的細胞死亡。氧化應激時產生的ROS(reactive oxygen species)可能是細胞凋亡(apoptosis)、鐵死亡(ferroptosis)以及程序性壞死(necroptosis)的重要傳播者和執行者[2-4]。然而根據細胞的狀態和誘導的條件不同，ROS介導何種細胞死亡方式目前尚不清楚。本研究利用SAS(柳氮磺吡啶)，谷氨酸/胱氨酸轉運體(glutamate/cystine antiporter,xc-)抑制劑，導致細胞內氧化應激，旨在觀察在氧化應激條件下，卵巢癌親本細胞SKOV3和耐藥細胞SKOV3/DDP能否發生程序性壞死、鐵死亡等非凋亡性細胞死亡途徑，同時對比兩種細胞死亡途徑的差異，為尋找卵巢癌耐藥的分子機制提供實驗依據和研究靶點。

1 材料與方法

1.1藥品、主要試劑和儀器IMDM 培養基、胰蛋白酶產自美國 Hy Clone 公司；1640培養基、DMEM培養基、新生牛血清產自美國 Gibco 公司；細胞培養板產自 Corning 公司；細胞培養皿產自Thermo公司；0.22 μm 濾膜、產自美國 Invitrogen 公司；Sulfasalazine (SAS)、MTT、壞死抑制劑Nec-1、鐵死亡抑制劑Fer-1產自美國 Sigma公司。RTCA DP(Real time cell analysis)來自美國羅氏公司。MLKL及磷酸化MLKL抗體購自Abcam公司。

1.2細胞培養及分組卵巢癌SKOV3、SKOV3/DDP細胞系均來自吉林大學病理學與病理生理學系研究室。卵巢癌SKOV3細胞用含有10%胎牛血清的1640培養液培養；卵巢癌SKOV3/DDP細胞在培養皿中，含有10%胎牛血清的IMDM培養液培養，卵巢癌SKOV3/DDP細胞每次傳代前加入1 μg/ml順鉑，以維持卵巢癌SKOV3/DDP細胞的耐藥性。細胞置于CO2培養箱(37℃，5% CO2)培養，隔2-3d傳代1次，接種后24 h于對數生長期的細胞用于實驗。實驗分組為對照組(Con)，SAS各劑量組。 應用鐵死亡抑制劑Fer-1，實驗分組為對照組，SAS組，Fer-1組，Fer-1與SAS聯合作用組。應用程序性壞死抑制劑Nec-1，實驗分組為對照組，SAS組，Nec-1組，Nec-1與SAS聯合作用組。

1.3MTT法測定細胞增殖抑制率SKOV3和SKOV3/DDP細胞接種于96孔培養板，每組細胞5復孔，于培養結束前4 h加入10 μl的MTT，培養結束后吸出去培養基，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩混勻15 min，使結晶完全溶解，用酶聯免疫檢測儀于490 nm波長處測定其吸光度(A)值。對照組細胞增殖抑制率為0%，其余各組細胞增殖抑制率=(對照組A值-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.4RTCA實時無標記細胞功能分析法實時連續分析細胞

先用培養液調零，然后按照每孔100 μl的培養液中含有8×103～1.5×104個細胞的濃度接種至金孔板，將金孔板嵌入RTCA的連接儀器，然后在37℃，含有5% CO2的細胞培養箱內繼續培養。當細胞長至對數生長期時，將原液棄掉，加入配置好的藥物，再將金孔板嵌入RTCA的連接儀器，然后在37℃，含有5% CO2的細胞培養箱內繼續培養。觀察細胞的實時生長曲線，當細胞的生長曲線達到要求時，結束培養，并利用RTCA Data Analysis Software 1.0軟件分析結果。

1.5Westernblotting法檢測細胞中MLKL和磷酸化MLKL蛋白表達用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，以β-actin的水平作為等量蛋白質上樣對照，取50 μg蛋白質樣品進行SDS-PAGE電泳，轉至硝酸纖維素膜上；5%奶粉室溫封閉2 h后，用含0.01% Tween20的TBS緩沖液漂洗3次，每次10 min；加入相應的抗體(1∶1000)，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1000)，37℃搖床溫育2 h；TBST漂洗3次，每次10 min；DAB顯色，凝膠圖像分析系統拍照，同時以β-actin為內參照，進行蛋白表達分析，蛋白表達水平以吸光度(A)值的比值表示，按照下列公式計算蛋白表達水平，并進行統計分析。蛋白表達水平=每個樣本條帶的A值/β-actin的A值。

2 結果

2.1SAS對SKOV3和SKOV3/DDP細胞生存率的影響

MTT實驗結果顯示，與對照組(Con)比較，不同濃度SAS作用 SKOV3細胞和SKOV3/DDP細胞，細胞生存率均降低(P<0.05)；與SKOV3細胞比較，相同濃度的SAS作用SKOV3/DDP細胞，細胞生存率降低程度不明顯，表明SKOV3 和SKOV3/DDP細胞對SAS的敏感性不同，SKOV3/DDP細胞對SAS耐受。其中，0.5 mM SAS作用SKOV3細胞，細胞生存率為(80±3)%，SAS 2 mM作用SKOV3/DDP細胞，細胞生存率為(80±4)%，這兩個劑量作為后續實驗所用劑量。見圖1。

圖1不同濃度SAS對SKOV3、SKOV3/DDP細胞生存率的影響n=3，*和#：comparedwithSASgroup

2.2MTT法檢測鐵死亡抑制劑Fer-1對SAS抑制SKOV3和SKOV3/DDP細胞生存率的影響

SKOV3 MTT結果顯示，與對照組(Con)比較，SAS作用SKOV3細胞組生存率為(79.5±1.1)%；與SAS 0.5 mM組比較，Fer-1各個濃度與SAS聯合作用24 h組SKOV3生存率沒有增加(P>0.05)；與對照組比較，不同濃度的Fer-1組生存率沒有差異(P>0.05)。見圖2。

SKOV3/DDP MTT結果顯示，與對照組(Con)比較，SAS生存為(78.9±1.6)%。與SAS 2mM組比較，Fer-1 1.0 μM和2.0 μM與SAS 2 mM聯合作用，SKOV3/DDP細胞生存率增加(P<0.05)。與Con組比較，單獨Fer-1各濃度組細胞生存率沒有統計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.3RTCA法檢測鐵死亡抑制劑Fer-1對SAS抑制SKOV3和SKOV3/DDP細胞生存率的影響

圖2MTT法檢測不同濃度Fer-1與SAS對SKOV3和SKOV3/DDP細胞生存率的影響(n=3)

SKOV3細胞RTCA法結果顯示，與對照組(Con)比較，SAS 0.5 mM作用SKOV3細胞生存率曲線降低；與SAS組比較，Fer-1各個濃度與SAS聯合24 h SKOV3生存率曲線降低。見圖3。

SKOV3/DDP細胞RTCA法結果顯示，與對照組(Con)比較，SAS 2 mM組生存率曲線降低，與SAS 2 mM組比較，Fer-1 1.0 μM和2.0 μM與SAS 2 mM聯合作用僅在24 h前，SKOV3/DDP細胞生存率曲線升高(P<0.05)。表明Fer-1作用24 h前能挽救SAS對SKOV3/DDP細胞生存率的抑制作用。見圖3。

圖3RTCA法檢測Fer-1與SAS聯合作用對SKOV3和SKOV3/DDP細胞生存率的影響(n=3)

2.4RTCA法檢測程序性壞死抑制劑Nec-1對SAS抑制SKOV3和SKOV3/DDP生存率的影響

SKOV3細胞RTCA結果顯示，與對照組(Con)比較，SAS 0.5 mM生存率曲線降低，與SAS 0.5 mM組比較，Nec-1 25 μM與SAS聯合作用組，隨著作用時間延長SKOV3細胞生存率曲線均低于SAS組的生存率曲線(P>0.05)。SKOV3/DDP細胞RTCA結果顯示，Nec-1 5 μM與SAS 2 mM聯合作用持續36 h，SKOV3/DDP細胞生存率曲線高于SAS組的生存率曲線，有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4RTCA法檢測Nec-125μM與SAS聯合作用對SKOV3和SKOV3/DDP細胞生存率的影響(n=3)

2.5Westernblotting法檢測程序性壞死標志蛋白的表達水平

Western bloting結果顯示在SAS作用卵巢癌SKOV3/DDP細胞12 h、24 h時，程序性壞死相關標志蛋白磷酸化MLKL蛋白(P-MLKL)表達增加(P<0.05)；而在SAS作用卵巢癌SKOV3細胞的各個時間點，P-MLKL表達沒有變化(P>0.05)。

3 討論

耐受順鉑是卵巢癌治療的瓶頸。盡管凋亡的誘導是最為廣泛使用的抗腫瘤策略，但由于化療藥物往往存在廣泛的凋亡缺陷、多藥耐藥等難以克服的問題，研究程序性壞死(necroptosis)、鐵死亡(ferroptosis)等非凋亡性程序性細胞死亡途徑更有意義[5-7]。本研究通過鐵死亡抑制劑以及程序性壞死抑制劑，利用實時無標記細胞功能分析法等方法證明SAS誘導卵巢癌親本細胞SKOV3和耐藥細胞SKOV3/DDP發生程序性壞死和鐵死亡途徑具有差異，與非耐藥細胞比較，耐藥細胞存在非凋亡性細胞死亡途徑。

柳氮磺吡啶(Sulfalsalazine，SAS)是Xc-系統抑制劑，抑制胱氨酸/谷氨酸反向轉運體不僅會影響胱氨酸依賴的谷胱甘肽合成，還會抑制胱氨酸的跨膜穿梭，這兩種作用都會損壞細胞的抗氧化系統，增加ROS 的積累，在機體的抗氧化應激中發揮關鍵作用[8]。2012年，Dixon 等[9,10]新提出了一種叫做鐵死亡(ferroptosis)的鐵依賴性的細胞死亡形式。鐵死亡的作用機制可能與谷氨酸的氧化毒性類似，SAS等藥物通過胱氨酸/谷氨酸轉運體抑制胱氨酸的吸收，從而破壞了細胞內氧化還原平衡的調節并且最終形成依賴于鐵離子的氧化性死亡。也已證實SAS誘導順鉑耐受的肺小細胞癌細胞發生凋亡[11]，SAS誘導神經膠質瘤細胞U251發生凋亡及自噬[12]。

細胞程序性壞死(Necroptosis)，又稱為壞死性凋亡，是一種既受死亡信號調控、又出現壞死樣結構特點的死亡形式，是一種可被壞死抑制劑Necrostain-1( Nec-1) 抑制的新細胞死亡方式，并且由機體內一系列信號轉導因子如RIP1、RIP3、MLKL 等高度調控的過程[13]。研究發現[14]，ROS 的大量產生和積聚是RIP3 蛋白依賴的，而且糖原磷酸化酶(PYGL)、谷氨酰胺合成酶(GLUL)和谷氨酸脫氫酶(GLUD1)參與調節。過量的ROS 使得線粒體膜的通透性改變誘發細胞程序性壞死。

本研究利用SAS誘導氧化應激，再分別聯合鐵死亡抑制劑Fer-1和程序性壞死抑制劑Nec-1，結果顯示Fer-1及Nec-1與SAS聯合作用SKOV3細胞，均不能挽救SAS對SKOV3細胞生存率的抑制作用。與SKOV3細胞比較，Fer-1作用24 h前挽救SAS對SKOV3/DDP細胞生存率的抑制作用，24 h后不能挽救SAS對SKOV3/DDP細胞生存率的抑制作用；Nec-1能全程性挽救SAS對SKOV3/DDP細胞生存率的抑制作用，表明耐藥細胞(SKOV3/DDP)均存在非凋亡性細胞死亡方式，即鐵死亡以及程序性壞死途徑，而非耐藥細胞(SKOV3)則不存在非凋亡性細胞死亡方式，推測可能只存在細胞凋亡途徑。接下來我們從蛋白水平上進一步證明。由于RIP1-RIP3 程序性壞死小體形成的必備條件之一，其作用底物為混合譜系激酶結構域樣蛋白(MKLK)。MKLK 是程序性壞死通路中RIP3 下游路徑中的一個關鍵酶。因此我們利用Western blotting法檢測磷酸化MLKL蛋白表達情況。結果顯示，與SAS作用0h比較，SAS作用不同時間點，SKOV3細胞磷酸化MLKL蛋白表達沒有變化，而SKOV3/DDP細胞中磷酸化MLKL蛋白表達增強。本研究對比觀察到非耐藥細胞及耐藥細胞在氧化應激條件下細胞死亡方式的差異，而且實時動態觀察到，氧化應激在不同時程時，鐵死亡與程序性壞死途徑所占據的比重不同，在氧化應激早期可見鐵死亡及程序性壞死，隨著氧化應激時間延長，只存在程序性壞死。

Zhang 等人[15]發現，不表達RIP3 基因的A細胞(一種NIH-3T3 細胞系)在腫瘤壞死因子TNF-α誘導下發生凋亡，而表達RIP3 基因的N 細胞(另一種NIH-3T3 細胞系)卻在TNF-α誘導下發生程序性壞死，表明RIP3在細胞程序性壞死與凋亡中的重要開關作用。由此可見，細胞死亡機制間構成了一個復雜的網絡系統，凋亡、自噬、程序性壞死等三種程序性壞死以及壞死，在非耐藥細胞及耐藥細胞中所占比例可能與腫瘤細胞本身狀態、腫瘤生存環境、化療藥物作用時間長短及損傷程度等因素密切相關。這四種死亡機制均參與化療藥物誘導腫瘤細胞死亡過程，且四者之間可能相互轉換、相互制約，在非耐藥細胞中可能某種機制占主導，但在耐藥細胞中可能共同參與化療藥物作用。

結合課題組前期研究結果，多功能蛋白P62蛋白在非耐藥細胞(SKOV3)中低表達，而在耐藥細胞(SKOV3/DDP)中高表達，根據兩種細胞死亡方式的不同，提示P62蛋白可能與腫瘤細胞的程序性壞死途徑有關。今后的研究中需要重點關注凋亡、程序性壞死和自噬在腫瘤化療藥物耐受中的作用，調控細胞死亡路徑之間的轉換將很好地拓寬治療惡性腫瘤的范圍。

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