TUNEL法檢測(cè)自擬復(fù)方葛根片對(duì)老齡大鼠子宮的保護(hù)作用

陶 利，王飛飛，李云江，張淑瑜，畢云生，于燕莉，徐建江

復(fù)方葛根片［1］是原濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院的醫(yī)院制劑，處方是由葛根、丹參、茵陳和延胡索四種中藥組成的，具有活血化瘀、生津養(yǎng)心的功效，臨床上主要用作冠心病、心絞痛以及心肌梗死等的治療。隨著年齡增長(zhǎng)，子宮組織及功能退化，影響身體健康。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定血清中雌激素水平［2，3］，以及采用TUNEL法［4］，對(duì)老齡大鼠的子宮進(jìn)行細(xì)胞凋亡情況檢測(cè)，來(lái)研究復(fù)方葛根片對(duì)老齡大鼠子宮的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料及儀器 復(fù)方葛根片（原濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院，批號(hào)：20151212，規(guī)格：0.4 g/片）；D-半乳糖（張家港市華昌藥業(yè)有限公司，批號(hào)：15121101，純度：≥98%），0.9%氯化鈉注射液（山東齊都藥業(yè)有限公司，批號(hào)：8B15101306）；TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 （批號(hào)：20161128）、Triton X-100 （批號(hào)：1286C380）、即用型 DAPI染色液（批號(hào)：20161222）均購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；雌二醇（批號(hào) CK-E30594R）、促卵泡激素 （批號(hào)：CKE30608R）、促黃體生成素（批號(hào)：CK-E30597R）、泌乳素（批號(hào)；CK-E30623R）試劑盒均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康大鼠（Wistar）共40只，♀，體質(zhì)量 200～250 g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（魯）2013-0009，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前，穩(wěn)定飼養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)環(huán)境：濕度 50%～70%，溫度25～27℃（室溫），自然光照。

1.2 方 法

1.2.1 D-半乳糖造模 40只大鼠，隨機(jī)分成5個(gè)組即：正常組、模型組、復(fù)方葛根片低、中、高劑量組，每組8只。以腹腔注射D-半乳糖溶液，來(lái)復(fù)制衰老模型，用藥劑量為250 mg/kg·d，D-半乳糖溶液由0.9%生理鹽水配制而成。正常組給予相同體積的生理鹽水。同時(shí)，復(fù)方葛根片高、中、低劑量組分別給予 1.35 g/kg、0.90 g/kg、0.45 g/kg的劑量， 給藥劑量按中藥藥理研究方法學(xué)計(jì)算［5］，藥品臨用前加純化水溶解，給藥劑量：10 ml/kg；正常組與模型組灌胃給予等量的純化水。連續(xù)用藥8周，稱(chēng)量大鼠的體質(zhì)量，1次/7 d，以便調(diào)整給藥劑量。

1.2.2 各組大鼠指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥以后，各組大鼠12 h內(nèi)禁食、不禁水，麻醉，腹腔靜脈取血，4℃離心（離心半徑為 5 cm，3 000 r/min）20 min，采集血清，-20℃保存，備用；摘取子宮，冰生理鹽水清洗，切割稱(chēng)重，-80℃保存，備用。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定血清中雌二醇（E2）濃度、促卵泡激素（FSH）濃度、促黃體生成素（LH）濃度、泌乳素（PRL）濃度，并根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)子宮切片進(jìn)行TRITC染色，檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.3 圖像采集與分析 采用熒光顯微鏡觀(guān)察各組大鼠的子宮組織切片，并采用數(shù)字成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。利用Image Por-plus6.0圖像分析軟件，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞和區(qū)域內(nèi)總細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比，即凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所測(cè)得得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方葛根片對(duì)血清E2、FSH、LH、PRL的影響與正常組比較，模型組大鼠血清E2濃度明顯降低，F(xiàn)SH、PRL、LH 濃度顯著升高（P＜0.01）；衰老模型建造成功；與模型組比較，復(fù)方葛根片各用藥劑量組大鼠 E2 濃度明顯升高（P＜0.05），F(xiàn)SH、PRL、LH濃度顯著降低（P＜0.05 或 P＜0.01）。 見(jiàn)表 1。

表1 對(duì)去卵巢更年期大鼠血清E2、FSH、LH、PRL的影響（x±s，n=8）

與正常組比較，模型組大鼠血清E2濃度明顯降低，F(xiàn)SH、PRL、LH 濃度顯著升高（P＜0.01）；衰老模型建造成功；與模型組比較，復(fù)方葛根片各用藥劑量組大鼠 E2 濃度明顯升高（P＜0.05），F(xiàn)SH、PRL、LH 濃度顯著顯著降低（P＜0.05 或 P＜0.01）。

2.2 子宮細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 圖1中紅色熒光代表凋亡細(xì)胞。陽(yáng)性組（A）為陽(yáng)性對(duì)照組（通透操作之后，陽(yáng)性片單獨(dú)滴加100 μl DNaseⅠ反應(yīng)液，37℃，處理30 min），全部顯示為紅色熒光，表示所有的細(xì)胞均被染色；陰性組（B）為陰性對(duì)照組（通透之后直接進(jìn)行檢測(cè)），全部不顯示熒光；與陽(yáng)性組（A）和陰性組（B）相比，模型組（C）、正常組（D）、復(fù)方葛根片高、中、低劑量組（E、F、G）中均顯示紅色熒光，表明該實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。與正常組（D）相比，模型組（C）熒光明顯增強(qiáng)，熒光區(qū)域明顯增大，且呈點(diǎn)線(xiàn)狀分布，細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）明顯升高（P＜0.05），表明造模成功。與模型組（C）相比，復(fù)方葛根片高、中、低劑量組（E、F、G）中紅色熒光均顯著減弱，熒光區(qū)域減小，呈星點(diǎn)狀分布，細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中低劑量組（G）中熒光比高劑量組（E）相對(duì)較多且明亮，高劑量組（E）中熒光點(diǎn)最少，幾乎不可見(jiàn)。表明復(fù)方葛根片有明顯的抑制衰老大鼠子宮細(xì)胞凋亡的作用。見(jiàn)圖 1，表 2。

圖1 各組大鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果（×200）

表2 各組大鼠子宮細(xì)胞凋亡率結(jié)果（n=8，x±s）

3 討論

雌激素是促進(jìn)女性附性器官成熟及第二性征出現(xiàn)，并維持正常性欲及生殖功能的激素。隨著年齡的增長(zhǎng)，雌激素的水平會(huì)不斷發(fā)生變化［6，7］。 老齡大鼠由于卵巢功能的退化，E2水平會(huì)明顯降低，而雌激素對(duì)垂體促性腺激素的分泌和合成呈負(fù)反饋?zhàn)饔谩４萍に厮降南陆担T導(dǎo)下丘腦弓狀核和室旁核脈沖式分泌促性腺激素釋放激素至門(mén)脈循環(huán)，進(jìn)而刺激垂體釋放FSH和LH增加，從而促進(jìn)PRL的分泌。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，模型組中E2濃度明顯下降，F(xiàn)SH、LH、PRL濃度明顯升高，表明衰老模型造模成功；與模型組相比，復(fù)方葛根片各用藥組中E2濃度升高，F(xiàn)SH、LH、PRL濃度出現(xiàn)不同程度的下降。表明復(fù)方葛根片能有效調(diào)節(jié)雌激素水平。

通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察，對(duì)子宮組織切片進(jìn)行TUNEL法［8］染色，其細(xì)胞凋亡的檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組中顯示大量的明亮熒光，表明凋亡細(xì)胞數(shù)量增多；與正常組相比，模型組中熒光點(diǎn)明顯增多且光點(diǎn)密集，凋亡指數(shù)（AI）明顯增加，說(shuō)明通過(guò)D-半乳糖制造衰老模型［9］，造模成功。復(fù)方葛根片高、中、低劑量組切片中熒光點(diǎn)減少，凋亡指數(shù)（AI）與模型組相比顯著降低。表明復(fù)方葛根片能夠抑制老齡雌性大鼠子宮中凋亡細(xì)胞的產(chǎn)生，延緩子宮衰老。

以上數(shù)據(jù)表明復(fù)方葛根片能有效抑制子宮細(xì)胞凋亡，并調(diào)節(jié)雌激素水平，起到延緩衰老，保護(hù)子宮的作用。

［1］于燕莉，梁愛(ài)君，張莉，等.復(fù)方葛根片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25（6）：524-526.

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［2017-12-29收稿，2018-01-25修回］