益腎散結法對大鼠腎臟間質纖維化組織TGF-β1和PAI-1表達的影響*

程小紅，邢 斌，劉建紅，趙英勇，毛加榮， 張曉鳳，于小勇

1.陜西省中醫藥研究院 陜西省中醫醫院(西安 710003)，2.西北大學生命科學院(西安 710069)

各種慢性腎臟疾病隨著病情的進展，均可出現程度不同的腎臟間質纖維化改變[1]。根據腎臟間質纖維化形成后的形態學特征與病理屬性特點，結合全身臨床表現，我們以益腎散結立法組方研制出院內制劑-腎復康Ⅱ號膠囊，應用于臨床10余年。本研究采用單側輸尿管梗阻方法復制大鼠腎臟間質纖維化模型，觀察益腎散結法中藥制劑-腎復康Ⅱ號膠囊對纖維化腎組織轉化生長因子β1(TGF-β1)和纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)表達的影響，以探討其部分作用機理。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物:清潔健康SD大鼠72只，雄性，2～3月齡，體重(200±20) g，購于西安交通大學醫學院動物中心，使用許可證號為SCXK(陜)2012-003。適應性喂養1周，隨機分為假手術組、模型組、治療組、對照組，每組18只。

1.2 研究用藥:腎復康Ⅱ號膠囊為院內制劑，由陜西省中醫醫院制劑中心提供，批號：陜藥管字[2001]第1168號；百令膠囊(國藥準字Z10910036，杭州中美華東制藥有限公司生產)。

1.3 主要實驗用儀器試劑:LeiCASM2000R型切片機、江蘇常州YABO石蠟包埋機、OlympusBX 41顯微鏡、北京中科 HMIAS-2000圖像采集與分析系統等由陜西省中醫醫院腎病實驗室提供。TGF-β1抗體及PAI-1抗體試劑盒(兔抗人、鼠多抗)、生物素藕聯羊抗兔IgG、鏈霉卵白素標記的辣根過氧化物酶(HRP)工作液、DAB染色劑：均購自武漢博士德生物制劑公司。

2 實驗方法

2.1 動物模型的制備:大鼠腎間質纖維化模型的復制采用目前公認而成熟的輸尿管結扎方法[2]。

2.2 實驗分組及給藥方法:將72只雄性SD大鼠隨機分為4組，平均每組18只。

治療組：以腎復康Ⅱ號膠囊顆粒405 mg/(kg·d)灌胃；對照組：以百令膠囊顆粒270 mg/(kg·d)灌胃；假手術組、模型組：均以生理鹽水灌胃。

將上述劑量的腎復康Ⅱ號膠囊顆粒和百令膠囊顆粒以溫開水溶解制成混懸液，于造模后一天開始給各組大鼠以1 ml/100g灌胃，假手術組及模型組大鼠同一時間以等體積的生理鹽水灌胃。

2.3 標本采集:分別于灌胃后第2周、3周、4周時每組處死6只動物，剖取左臟以10%甲醛固定，留作病理檢查標本。

2.4 觀測指標

2.4.1 腎臟間質纖維化相對面積:將腎臟組織切片進行Masson染色，用日本奧林帕斯光學顯微鏡觀察腎臟間質纖維化情況，以圖像采集系統在光鏡20倍下采集腎皮質中10個不含腎小球且互不重疊的視野，以圖像分析系統計算每例切片、每個視野腎臟間質的綠染面積，計算平均數作為腎臟間質纖維化的面積[3]。

2.4.2 普通光學顯微鏡下觀察腎纖維化組織TGF-β1、PAI-1免疫組化染色表達情況:將石蠟包埋的腎臟組織切片，根據試劑盒說明書介紹的方法及步驟進行TGF-β1、PAI-1免疫組化染色，用日本奧林帕斯光學顯微鏡觀察TGF-β1及PAI-1表達情況。

結 果

1 各組腎臟間質纖維化情況 將腎組織切片進行Masson染色。厚度為3μm的石蠟切片脫蠟至水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5 min，酒精1 min；10%重鉻酸鉀與10%三氯醋酸1∶1的比例混合染15 min；水洗、蒸餾水洗；1%天青石蘭染8 min；水洗、蒸餾水洗；Mager蘇木素染6 min；水洗、蒸餾水洗；在1%的冰醋酸中放置2 min，取出擦干組織周圍的冰醋酸放在濕盒中；將1%的酸性品紅與1%的麗春紅以2∶1的比例混合滴在組織上染22 min；用1%的冰醋酸將切片的品紅、麗春紅洗干凈后在磷鉬酸中涮幾下，滴染亮綠5 min；用1%的冰醋酸洗干凈亮綠，擦干組織周圍的冰醋酸，直接以100%酒精快速脫水、透明、封片。顯微鏡下20倍視野觀察病理變化，各時間點各組大鼠腎小管及腎臟間質病理變化情況見圖1。假手術組大鼠腎小管及腎間質結構正常；隨著時間的延長，模型組腎臟間質纖維化程度逐漸加重；與模型組比較，治療組及對照組腎臟間質纖維化程度較輕。結果見表1。

假手術組 UUO UUO+腎復康Ⅱ號膠囊 UUO+百令膠囊

圖1 各組腎組織Masson染色病理改變(Masson染色×20)

注：與假手術組比較,△P<0.05;與模型組比較，*P<0.05;治療組與對照組比較,☆P>0.05

表1可見,模型組及藥物組、對照組腎臟間質均有不同程度的纖維化，與假手術組相比具有顯著差異 (P<0.05)。在14 d、21 d、28 d三個不同觀測時點，治療組及對照組腎臟間質纖維化面積增加程度均明顯較模型組為輕，纖維化面積較模型組明顯減少(P<0.05)；但治療組和對照組之間無顯著差異(P>0.05)，說明治療藥物-腎復康Ⅱ號膠囊和對照藥物-百令膠囊均對腎臟間質纖維化的形成有一定抑制作用。

2 腎組織TGF-β1、PAI-1免疫組化染色表達情況

2.1 腎組織TGF-β1、PAI-1免疫組化染色方法:將各組3～4 μm腎組織石蠟切片，脫蠟、水化、滅活、微波修復抗原。滴加5% BSA封閉液，室溫20 min，分別加PAI-1抗體(兔抗人、鼠多抗)稀釋度1∶300、TGF-β1抗體(兔抗人、鼠多抗)稀釋度1∶50，37度烤箱孵育1 h，加生物素化山羊抗小鼠IgG，室溫下孵育15～20 min，加鏈霉卵白素標記的辣根過氧化物酶(HRP)工作液室溫下孵育15～20 min，DAB顯色15 min，蘇木素中復染細胞核2 min，二甲苯透明，中性樹脂封片。顯微鏡下20倍視野觀察染色表達情況。

2.2 腎組織免疫組化染色TGF-β1表達情況:見圖2。

假手術組 UUO UUO+腎復康Ⅱ號膠囊 UUO+百令膠囊

圖2 各組腎組織免疫組化染色TGF-β1表達情況(免疫組化染色× 20)

圖2可見,在假手術組，第2周和第3周TGF-β1均無表達，第4周時僅有少量表達；在模型組，各時間觀測點TGF-β1均明顯表達，且隨時間延長而更加顯著； 治療組及對照組，在各時間觀測點TGF-β1表達均較模型組減弱，說明治療藥物腎復康Ⅱ號膠囊和對照藥物百令膠囊均能抑制TGF-β1在腎間質中的過度表達。

2.3 腎組織免疫組化染色PAI-1表達情況:見圖3。腎復康Ⅱ號膠囊和百令膠囊均能抑制PAI-1的表達。

假手術組 UUO UUO+腎復康Ⅱ號膠囊 UUO+百令膠囊

圖3 各組腎組織免疫組化染色PAI-1表達情況(免疫組化染色×20)

圖3可見,在假手術組，各時間觀測點PAI-1均無表達；在模型組，各時間觀測點PAI-1均明顯表達，且隨時間延長而更加顯著； 治療組及對照組，在各時間觀測點PAI-1表達均明顯較模型組為弱，說明治療藥物-腎復康Ⅱ號膠囊和對照藥物-百令膠囊均能抑制PAI-1在腎間質中的表達。

討 論

在腎組織中，所有固有細胞均可表達和分泌TGF-β1[4]。TGF-β1能刺激成纖維細胞以增加細胞外基質

(ECM)成分合成，抑制多種ECM降解酶活性從而抑制ECM降解，可促使腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉分化[5]。PAI-1能抑制ECM降解，導致或促進組織器官硬化或纖維化。PAI-1也是一個重要的促纖維化因子[6]，各種原因所致腎損傷時均有不同程度的表達[7]。

單側輸尿管梗阻導致腎臟間質纖維化模型的特點是進行性的小管萎縮和腎間質纖維化，腎臟間質纖維化即腎組織瘢痕形成后，病理改變具有固定不移、經久不愈的特點，與“瘀血”致病特征相似[8]，腎小管功能障礙為主要臨床表現，常出現夜尿增多、乏力等脾腎氣虛證候，故“益腎散結”是微觀辨證與整體辨證有機結合而確立的治法。既往研究證明，“益腎散結”中藥制劑-復康Ⅱ號膠囊能減輕腎臟間質纖維化的程度[9-10]。研究結果顯示：UUO組、治療組及對照組大鼠腎纖維化組織中TGF-β1、PAI-1表達顯著高于假手術組，也證明TGF-β1、PAI-1是促進腎臟間質纖維化的主要因子。但治療組和對照組與模型組比較，TGF-β1、PAI-1表達明顯減弱，表明腎復康Ⅱ號膠囊抑制腎臟間質纖維化形成的部分機制，是通過抑制腎臟組織TGF-β1和PAI-1表達而實現的。盡管腎復康Ⅱ號膠囊和對照藥物百令膠囊均對腎臟局部的病理改變有相似的作用，但針對全身表現而“益腎”、針對腎臟局部病理改變而“散結”是其優勢所在。

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