球囊損傷血管內(nèi)膜組織CD36和Prdx-2蛋白表達

[摘要]目的觀察球囊損傷血管內(nèi)膜的增生情況及其內(nèi)CD36和過氧化物酶基因-2（Prdx-2）蛋白的表達。方法將32只雄性Wistar大鼠隨機分為假手術對照組和球囊損傷手術組，每組16只。球囊損傷手術組用球囊損傷大鼠主動脈內(nèi)膜。分別于術后14、28 d取兩組大鼠主動脈血管壁，行蘇木精-伊紅染色后測量血管壁內(nèi)膜和中膜厚度，并用免疫組織化學方法檢測血管內(nèi)膜中CD36和Prdx-2蛋白的表達。結果球囊損傷術后14、28 d，大鼠血管壁內(nèi)膜及中膜顯著增生。球囊損傷后血管內(nèi)膜中CD36蛋白表達水平增高，與血管內(nèi)膜厚度呈正相關（r=0.662，P<0.01）;Prdx-2蛋白表達水平降低，與血管內(nèi)膜厚度呈負相關（r=-0.516，P<0.05）。結論血管內(nèi)皮損傷修復過程中存在內(nèi)膜增生，CD36蛋白表達上調(diào)及Prdx-2蛋白表達下調(diào)可能與血管平滑肌細胞移行、增生及損傷后再狹窄的發(fā)生有關。

[關鍵詞]冠狀動脈再狹窄;血管內(nèi)膜;創(chuàng)傷和損傷;抗原，CD36;過氧化物酶;大鼠，Wistar

[中圖分類號]R543.3[文獻標志碼]A[文章編號] 2096-5532（2018）06-0680-04

EXPRESSION OF CD36 AND PRDX-2 PROTEINS IN AORTIC INTIMA AFTER BALLOON INJURY "ZHOU Jingwei， REN Beibei， XU Wanqun， MA Chengtai， LI Yonghong（Department of Emergency， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266100， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate intimal hyperplasia after balloon injury and the expression of CD36 and Prdx-2 in aortic intima. MethodsA total of 32 male Wistar rats were randomly divided into sham-operation control group and balloon injury group， with 16 rats in each group. In the balloon injury group， the aortic intima was injured by a balloon. The aortic wall was collected on days 14 and 28 after surgery; hematoxylin and eosin staining was performed to measure intima-media thickness， and immunohistochemistry was used to measure the expression of CD36 and Prdx-2 proteins in the aortic intima. ResultsThere was significant intimal-medial hyperplasia on days 14 and 28 after surgery. After balloon injury， there was an increase in the expression of CD36 protein in the aortic intima， which was positively correlated with intimal thickness （r=0.662，Plt;0.01）， and there was a reduction in the expression of Prdx-2 protein， which was negatively correlated with intimal thickness （r=-0.516，Plt;0.05）. ConclusionIntimal hyperplasia is observed during the repair of vascular endothelial injury. Upregulation of CD36 protein and downregulation of Prdx-2 protein may be associated with the migration and proliferation of vascular smooth muscle cells and res-tenosis after injury.

[KEY WORDS]coronary restenosis; tunica intima; wounds and injuries; antigens， CD36; peroxidase; rats， Wistar

經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術（PTCA）是目前公認的治療冠心病的有效手段，但較高的術后再狹窄發(fā)生率嚴重影響了其臨床療效[1]。PTCA術后再狹窄的原因和機制復雜，一般認為以血管平滑肌細胞（VSMC）增殖及遷移為主的新生內(nèi)膜過度增生是再狹窄發(fā)生的主要機制[2-3]。目前大量分子生物學水平的研究顯示，氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）與其受體血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體結合，激活氧化應激，刺激VSMC的增殖和遷移，可促進內(nèi)膜增生，進而誘導再狹窄的發(fā)生[4-5]。CD36是ox-LDL的另一種受體，參與脂質(zhì)分子（包括ox-LDL）的攝取及血栓形成[6-7]。過氧化物酶基因-2（Prdx-2）為CD36的下游分子，具有抗氧化及自由基清除作用。CD36和Prdx-2是否參與了PTCA術后再狹窄的發(fā)生，目前國內(nèi)外未有報道。本研究擬通過觀察球囊損傷大鼠主動脈后血管內(nèi)膜增生過程中CD36和Prdx-2的表達，從分子水平探討CD36和Prdx-2參與再狹窄發(fā)生的機制，為PTCA術后再狹窄的防治提供新的研究思路。

1材料與方法

1.1動物分組及模型制備

將32只10周齡雄性Wistar大鼠（購自青島藥檢所，體質(zhì)量280～340 g）隨機分為假手術對照組（簡稱對照組）和球囊損傷手術組（簡稱手術組），每組16只。所有大鼠術前禁食12 h，術前1 d至術后

6期周經(jīng)緯，等. 球囊損傷血管內(nèi)膜組織CD36和Prdx-2蛋白表達681

3 d每天給予青霉素10萬單位腹腔注射預防感染。手術組大鼠應用0.6 mol/L水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射全身麻醉后，于大鼠頸部正中略偏左處剪一長約3 cm的切口，用手術器械鈍性分離出左頸總動脈，將自制2 F球囊導管插入動脈切口處，并沿主動脈走行方向送至腹主動脈下端，球囊內(nèi)注入生理鹽水0.1 mL，反復抽拉導管3次，使其主動脈內(nèi)皮剝脫完全。手術結束后，取出球囊導管，結扎左頸總動脈，并依次縫合肌肉、皮膚。對照組大鼠除不插入球囊導管外，其余操作同手術組。

1.2組織學檢查

于術后14、28 d，兩組各處死8只大鼠，取腹主動脈段4～5 cm，常規(guī)制備切片，蘇木精-伊紅染色，隨機選取5個區(qū)域視野，在光鏡下觀察VSMC移行、增殖及內(nèi)膜增生的情況，并用圖像分析儀測量內(nèi)膜、中膜的厚度。

1.3CD36和Prdx-2蛋白的表達檢測

采用免疫組化SP法進行檢測，按照常規(guī)步驟操作。CD36一抗購自北京博奧森生物技術有限公司，Prdx-2一抗購自美國abcam抗體公司;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔、兔抗山羊二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。染色后隨機選取5個區(qū)域視野，采用Simple PCI分析系統(tǒng)檢測CD36以及Prdx-2蛋白的平均吸光度值。

1.4統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，樣本均數(shù)間比較采用t檢驗;相關性檢驗采用Person相關性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1動物模型的存活情況

所有32只大鼠均存活，無大鼠因手術過程或術后感染死亡。

2.2組織學檢查

術后14 d，手術組大鼠主動脈內(nèi)皮細胞已覆蓋大部分損傷面，內(nèi)膜中有大量VSMC增殖，內(nèi)膜增生明顯;中膜內(nèi)VSMC增多，中膜增生。術后28 d，手術組大鼠主動脈內(nèi)皮細胞幾乎覆蓋全部損傷面，增殖的VSMC明顯減少，但細胞外基質(zhì)成分增加，內(nèi)膜繼續(xù)增生。術后14及28 d時，與對照組比較，手術組大鼠主動脈內(nèi)膜和中膜明顯增厚，差異有顯著性（t=11.71～28.10，P<0.01）。見表1。

2.3血管內(nèi)膜中CD36和Prdx-2蛋白的表達

CD36蛋白主要表達于血管內(nèi)膜的內(nèi)皮細胞和VSMC中，而Prdx-2蛋白主要表達于血管內(nèi)膜的VSMC。術后14、28 d時，與對照組比較，手術組大鼠主動脈血管內(nèi)膜中CD36蛋白的表達水平均明顯增高（t=2.236、5.564，P<0.05），而Prdx-2蛋白的表達水平均明顯下降（t=3.176、7.022，P<0.01）。見表2。

2.4血管內(nèi)膜厚度與CD36、Prdx-2蛋白表達強度的相關性

球囊損傷后主動脈血管內(nèi)膜厚度與CD36蛋白表達水平呈正相關（r=0.662，P<0.01），與Prdx-2蛋白表達水平呈負相關（r=-0.516，P<0.05）。球囊損傷術后，隨著CD36蛋白的表達增加，Prdx-2蛋白表達逐漸降低，但二者的表達水平無明顯相關性（P>0.05）。

3討論

PTCA術后再狹窄是冠心病介入治療的難點之一，目前其發(fā)生機制尚未完全闡明。多項研究顯示，支架術后再狹窄是一個復雜的病理生理過程，主要與血管內(nèi)皮損傷和增生、VSMC的遷移和過度增殖、持續(xù)的炎癥反應、冠狀動脈內(nèi)血栓形成、細胞外基質(zhì)重構和肉芽組織增生、血管壁彈性回縮及重塑等有關[8]。隨著藥物洗脫支架（DES）和藥物涂層球囊（DCB）技術的出現(xiàn)，支架術后再狹窄的發(fā)生率已經(jīng)由20%～40%下降至5%～10%[9]。然而，藥物抵抗等因素使得DES術后再狹窄率仍較高[10-11]，DCB則因不能克服血管壁彈性回縮力，不能完全避免支架術后再狹窄的發(fā)生，其臨床療效仍缺乏大樣本數(shù)據(jù)支持。因此，本研究進一步探討了支架術后再狹窄發(fā)生過程中VSMC過度增生的分子機制，以期尋找新的靶點，指導支架術后再狹窄的臨床防治。

本實驗通過建立大鼠主動脈內(nèi)皮球囊損傷模型觀察到，球囊損傷術后14及28 d大鼠主動脈存在血管重塑：術后14 d，內(nèi)皮細胞已覆蓋大部分損傷創(chuàng)面，內(nèi)膜增生明顯并可見大量增殖的VSMC，中膜內(nèi)彈力層迂曲增生;術后28 d，內(nèi)膜中VSMC增殖明顯減弱，但由于細胞外基質(zhì)成分的增加，內(nèi)膜繼續(xù)增生。上述結果與既往的文獻報道相符[12-13]，證實了血管重塑過程中存在VSMC的過度增生。

CD36是一種細胞膜糖蛋白，屬于B類清道夫受體，對ox-LDL具有高度親和性。CD36廣泛存在于多種類型的細胞，如單核/巨噬細胞、血小板、血管內(nèi)皮細胞等。CD36也是一種黏附分子，在內(nèi)皮損傷的早期即可啟動單核細胞及內(nèi)皮細胞的黏附，單核細胞黏附于血管內(nèi)膜，向內(nèi)膜下遷移并分化為巨噬細胞，進而吞噬大量ox-LDL形成泡沫細胞，并促進VSMC增生及動脈粥樣硬化斑塊形成。CD36基因敲除的巨噬細胞對ox-LDL的結合及降解能力顯著減弱，因此細胞膽固醇脂類的沉積也明顯減少[14]。另有研究顯示，與野生型小鼠相比，CD36基因敲除的小鼠在動脈損傷后血栓形成時間延長，且血管壁內(nèi)活性氧分子（ROS）水平明顯降低。SILVERSTEIN等[15]研究證明，CD36活化可促進血栓形成。因此，CD36可能通過促進血管壁脂質(zhì)沉積、VSMC增生及血栓形成等參與PTCA術后再狹窄的發(fā)生。本研究結果顯示，PTCA術后大鼠血管壁內(nèi)CD36蛋白表達水平較對照組明顯增高，且其表達水平與內(nèi)膜厚度呈正相關，證實了CD36蛋白在PTCA術后再狹窄發(fā)生過程中的作用。

過氧化物酶基因（Prdxs）蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的一類過氧化物酶，屬于抗氧化蛋白超家族，廣泛存在于原核生物和真核生物中。哺乳動物的Prdxs家族包括6個成員，即Prdx-1～Prdx-6，其中Prdx-2蛋白具有抗氧化及自由基清除、參與細胞的增生和分化、信號傳導、增強自然殺傷細胞活性的能力等功能。在Prdx2-/-的頸動脈化學損傷模型小鼠中，血管壁內(nèi)ROS產(chǎn)生明顯增加，血栓形成時間縮短。本文研究結果顯示，球囊損傷后血管壁內(nèi)Prdx-2蛋白表達下降，其表達水平與血管內(nèi)膜厚度呈負相關，提示Prdx-2蛋白可抑制血管內(nèi)皮修復過程中的內(nèi)膜過度增生。故推測外源性轉(zhuǎn)入Prdx-2蛋白或提高內(nèi)源性Prdx-2蛋白的表達水平，可以預防PTCA術后再狹窄的發(fā)生，我們后續(xù)的研究也將對這一設想進行驗證。

LI等[16]的研究結果顯示，在CD36基因敲除的小鼠，VSMC內(nèi)Prdx-2表達上調(diào)，提示CD36蛋白可能作為Prdx-2的上游分子，抑制VSMC內(nèi)Prdx-2的表達，誘導氧化應激反應，延長血栓形成時間。因此我們推測，在球囊損傷后的修復過程中，CD36作為ox-LDL的高親和力抗體，與ox-LDL結合后一方面促進局部脂質(zhì)沉積、VSMC增殖及血栓形成;另一方面抑制局部Prdx-2蛋白的表達，促進局部血栓形成及VSMC的增殖、遷移。本研究中，雖然在球囊損傷后血管壁內(nèi)CD36蛋白表達增加的同時，Prdx-2蛋白表達降低，但二者的表達水平無明顯相關性。推測這可能與下述因素有關：①研究例數(shù)較少;②除Prdx-2外，CD36蛋白還通過其他下游分子調(diào)節(jié)VSMC的增殖。

綜上所述，PTCA術后再狹窄目前的機制尚未完全闡明，尚需更多深入的研究。本研究證實了在PTCA術后再狹窄血管內(nèi)膜和中膜增生過程中伴隨著CD36蛋白表達上調(diào)及Prdx-2蛋白表達下調(diào)，這可能與PTCA術后再狹窄發(fā)生機制相關，其具體機制有待于在后續(xù)研究中進一步探討。

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