XAV939對(duì)H446細(xì)胞增殖及Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因的影響

[摘要]目的探討Wnt信號(hào)通路抑制劑XAV939對(duì)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞增殖及Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因的影響。方法采用CCK8法檢測(cè)XAV939、順鉑分別作用及兩藥聯(lián)合作用時(shí)抑制H446細(xì)胞增殖情況，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白β-catenin和細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1） mRNA的表達(dá)。結(jié)果XAV939及順鉑均對(duì)H446細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，呈濃度依賴性（F=72.175～1 091.974，Plt;0.01），其中XAV939作用無(wú)時(shí)間依賴性（Pgt;0.05），而順鉑作用有明顯時(shí)間依賴性（t=4.690～10.267，Plt;0.01）。兩藥在低效應(yīng)劑量（falt;0.2）時(shí)合用指數(shù)（CI）gt;1;在高效應(yīng)劑量（fa≥0.2）時(shí)CIlt;1。RT-PCR結(jié)果顯示，XAV939處理后β-catenin和Cyclin D1 mRNA表達(dá)下降，表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。結(jié)論XAV939具有明顯抑制H446細(xì)胞增殖的作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞]小細(xì)胞肺癌;Wnt信號(hào)通路;XAV939;細(xì)胞增殖;細(xì)胞周期蛋白D1

[中圖分類號(hào)]R734.2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號(hào)] 2096-5532（2018）06-0710-04

EFFECTS OF XAV939 ON H446 CELL PROLIFERATION AND WNT SIGNALING PATHWAY-RELATED GENES "PAN Fei， YANG Lijun， ZHANG Lijian， GUO Wenxuan， TIAN Jinxin， SHEN Fangzhen （Department of Oncology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effects of the Wnt signaling pathway inhibitor XAV939 on the proliferation of human small cell lung cancer H446 cells and Wnt/β-catenin signaling pathway-related genes. MethodsCell Counting Kit-8 was used to determine the inhibitory effect of XAV939 and cisplatin， alone or in combination， on the proliferation of H446 cells， and RT-PCR was used to determine the mRNA expression of β-catenin and cyclin D1 as key proteins in the Wnt signaling pathway. ResultsBoth XAV939 and cisplatin significantly inhibited the proliferation of H446 cells in a concentration-dependent manner （F=72.175-1 091.974，Plt;0.01）. The effect of XAV939 was not time-dependent （Pgt;0.05）， while the effect of cisplatin was significantly time-dependent （t=4.690-10.267，Plt;0.01）. The combination index （CI） of XAV939 and cisplatin was gt;1 at a low fraction-affected dose （falt;0.2）， and CI was gt;1 at a high fraction-affected dose （fa≥0.2）. RT-PCR results showed that the mRNA expression of β-catenin and cyclin D1 was reduced after XAV939 treatment， showing a significant concentration depen-dence. ConclusionXAV939 has a significant inhibitory effect on the proliferation of H446 cells， possibly by inhibiting the Wnt/β-catenin signaling pathway.

[KEY WORDS]small cell lung carcinoma; wnt signaling pathway; xav939; cell proliferation; Cyclin D1

肺癌是目前全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在男性和女性的癌癥死因中均居首位[1]。小細(xì)胞肺癌是一種高死亡率的侵襲性惡性腫瘤，占所有肺癌類型的15%。在過(guò)去的30年里，小細(xì)胞肺癌的治療研究鮮

有重大進(jìn)展[2]。因此，急需尋找新方法去預(yù)防或者治療小細(xì)胞肺癌。有研究結(jié)果顯示，XAV939和IWR-endo等為Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的最新小分子抑制劑[3]，它們的作用靶點(diǎn)是端錨聚合酶。端錨聚合酶在多種類型癌癥中表達(dá)上調(diào)，包括乳癌、直腸癌、膀胱癌和非霍奇金淋巴瘤[4-8]。最近研究表明，在乳癌、結(jié)腸癌及非小細(xì)胞肺癌中，XAV939可以通過(guò)阻斷Wnt信號(hào)通路抑制腫瘤生長(zhǎng)[9-10]。但迄今為止，XAV939對(duì)小細(xì)胞肺癌作用的研究很少。本文旨在探討XAV939對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的作用及其機(jī)制。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H446購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。用含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清及2 mL雙抗（青霉素和鏈霉素按1∶1混合）的RPMI-1640培養(yǎng)液，放置于37 ℃、相對(duì)濕度為10%、含有體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。XAV939（C4H11F3N2OS）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;順鉑購(gòu)自澳大利亞Hospira Austrilia Pty Ltd公司;SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Prime Script RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;MiRNA Real-Time PCR Assay Kit購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司。

1.2CCK8方法檢測(cè)XAV939對(duì)H446細(xì)胞增殖作用影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H446細(xì)胞調(diào)整密度為1×108/L，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，將其置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，至96孔板底部被細(xì)胞全部鋪滿。實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、XAV939單藥組、順鉑單藥組及兩藥聯(lián)合組。陰性對(duì)照組不添加任何藥物;XAV939單藥組又分為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L濃度組;順鉑組分為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L濃度組;兩藥聯(lián)合組XAV939和順鉑的比例為1∶1，每孔的用藥量與單藥組相同，劑量各占總劑量的50%。各組分別加入10 μL不同濃度的藥物，每種濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，然后向每孔中加入10 μL的CCK-8溶液。將96孔板繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)放置1～4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm波長(zhǎng)吸光度（A值），結(jié)果取3個(gè)復(fù)孔的平均值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率=1-（實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值）×100%。

1.3逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測(cè)XAV939對(duì)β-catenin和細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）mRNA表達(dá)影響

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組不添加任何藥物;實(shí)驗(yàn)組分別加入10、20、40 μmol/L濃度的XAV939處理24 h，每種濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。提取各組細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由江蘇南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L的凝膠電泳后，在凝膠成像儀上成像，分析條帶的亮度及豐度比值。

2結(jié)果

2.1XAV939單藥對(duì)H446細(xì)胞增殖抑制率影響

在相同處理時(shí)間下，隨著XAV939濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=72.175、77.284，Plt;0.01）。在相同藥物濃度下，隨著藥物作用的時(shí)間增加，細(xì)胞抑制率也在緩慢上升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。見(jiàn)表2。XAV939作用24 h的半數(shù)抑制率（IC50）為21.56 μmol/L。

2.2順鉑單藥對(duì)H446細(xì)胞增殖抑制率的影響

在相同作用時(shí)間下，隨著順鉑濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=703.827、1 091.974，Plt;0.01）;在相同濃度下，隨著順鉑作用時(shí)間的增加，細(xì)胞增殖抑制率也不斷升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.690～10.267，Plt;0.05）。見(jiàn)表3。順鉑作用24 h的IC50為1.91 mg/L。

2.3XAV939聯(lián)合順鉑對(duì)H446細(xì)胞增殖抑制率的影響

順鉑與XAV939聯(lián)合組隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 248.72、1 437.682，Plt;0.05）。隨著藥物濃度的逐漸增加，細(xì)胞增殖抑制率也逐漸升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.869～20.774，Plt;0.01）。見(jiàn)表4。順鉑聯(lián)合XAV939對(duì)H446細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。根據(jù)順鉑聯(lián)合XAV939作用人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)不同效應(yīng)下的聯(lián)合指數(shù)（CI），繪制成折線圖，見(jiàn)圖1。當(dāng)抑制效應(yīng)（fa）lt;0.2，CIgt;1，兩藥聯(lián)合效應(yīng)為拮抗;當(dāng)fa≥0.2，CIlt;1，兩藥聯(lián)合效應(yīng)為協(xié)同。

2.4XAV939對(duì)H446細(xì)胞β-catenin以及Cyclin D1 mRNA表達(dá)影響

與對(duì)照組相比較，各濃度藥物組人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞β-catenin及Cyclin D1 mRNA表達(dá)均受到抑制，并且呈現(xiàn)濃度依賴性。見(jiàn)圖2。

3討論

由于小細(xì)胞肺癌具有極強(qiáng)的侵襲性，導(dǎo)致診斷時(shí)局限期病人占1/3，廣泛期病人占2/3，僅有少數(shù)早期的病人具有手術(shù)指征。由于廣泛期病人失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，因此目前化療是其最主要和最基礎(chǔ)的治療手段，放療在治療中也起著相當(dāng)重要的作用。以順鉑為主的聯(lián)合化療方案已成為小細(xì)胞肺癌治療的標(biāo)準(zhǔn)方案。順鉑是一種細(xì)胞周期非特異性化療藥，可以對(duì)癌細(xì)胞DNA的復(fù)制過(guò)程起到抑制作用，并對(duì)其細(xì)胞膜上的結(jié)構(gòu)造成損傷，有著很強(qiáng)的廣譜抗癌作用。但是由于部分病人無(wú)法忍受其嚴(yán)重的胃腸道等不良反應(yīng)，在很大程度上限制了其臨床應(yīng)用。

隨著分子靶向藥物如厄羅替尼、埃克替尼等在非小細(xì)胞肺癌治療上的廣泛應(yīng)用，極大延長(zhǎng)了病人的總生存期和無(wú)病進(jìn)展期。但相比之下，目前靶向治療小細(xì)胞肺癌的臨床研究進(jìn)展非常緩慢。因此，迫切需要找到有效的分子靶點(diǎn)去改善這一臨床困境。1973年，SHARMA等[11]在果蠅的胚胎發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)了一種可以導(dǎo)致無(wú)翅表型的基因，稱為Wingless（Wg）基因。NUSSE[12]于1982年在小鼠乳房腫瘤病毒的研究中發(fā)現(xiàn)了整合基因（Int-1）。隨后大量研究證實(shí)Wg與Int-1為同源基因，因此研究者將二者合并命名為Wnt基因[13]。目前，已經(jīng)在多種類型的癌癥中發(fā)現(xiàn)了異常激活的Wnt信號(hào)通路，包括直腸癌、急性髓細(xì)胞白血病、乳癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌等[14-17]。提示W(wǎng)nt信號(hào)途徑可能是小細(xì)胞肺癌治療中一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。

以前的研究表明，在標(biāo)準(zhǔn)的Wnt信號(hào)通路中，Wnt蛋白配體通過(guò)與Fz卷曲受體和LRP5/6受體結(jié)合，從而激活通路促使β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)集聚[18]。在細(xì)胞核內(nèi)β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子（TCF）和淋巴增強(qiáng)結(jié)合因子（LEF）結(jié)合，進(jìn)而激活下游靶基因c-myc、Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄[19]。正常情況下，由APC蛋白、Axin蛋白和GSK-3β共同形成降解復(fù)合物，負(fù)責(zé)下調(diào)β-catenin的水平。有研究結(jié)果顯示，端錨聚合酶抑制劑XAV939能夠有效抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路[3]。

XAV939的作用機(jī)制是通過(guò)增加β-catenin降解復(fù)合物和穩(wěn)定Axin蛋白表達(dá)來(lái)阻止Wnt信號(hào)通路。

本文研究采用CCK8方法檢測(cè)XAV939對(duì)小細(xì)胞肺癌增殖的作用。結(jié)果顯示，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度的XAV939處理后細(xì)胞增殖受到抑制，其作用具有劑量依賴性，而無(wú)時(shí)間依賴性;順鉑對(duì)小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞增殖抑制也有抑制作用，并且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性和劑量依賴性;XAV939和順鉑兩藥聯(lián)合低劑量時(shí)對(duì)小細(xì)胞肺癌增殖作用有抵抗效應(yīng)，而在高劑量時(shí)則表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。究其原因，可能是因?yàn)轫樸K長(zhǎng)期作用癌細(xì)胞時(shí)，增強(qiáng)了癌細(xì)胞中DNA的修復(fù)能力并提高了藥物的解毒性等從而造成耐藥。當(dāng)XAV939的劑量達(dá)到一定水平時(shí)，可能對(duì)DNA的修復(fù)產(chǎn)生抑制，使c-fos基因表達(dá)降低，癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性得到提高，最終二者發(fā)揮協(xié)同效應(yīng);而當(dāng)XAV939的劑量處于較低水平時(shí)，二者各自發(fā)揮自身作用，不會(huì)產(chǎn)生明顯的協(xié)同效應(yīng)。因此，找到XAV939與順鉑合用合適的劑量比例，就有可能獲得較好的療效同時(shí)使不良反應(yīng)降低。

本研究同時(shí)采用RT-RCR方法檢測(cè)Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)情況，以進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。結(jié)果顯示，經(jīng)XAV939處理24 h后，β-catenin和Cyclin D1 mRNA的表達(dá)均出現(xiàn)了明顯的下調(diào)。提示XAV939可能通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白β-catenin的表達(dá)，進(jìn)而降低了下游關(guān)鍵因子Cyclin D1的表達(dá)。

綜上所述，體外XAV939對(duì)小細(xì)胞肺癌的增殖有著明顯的抑制作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。由于體外實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)藥物相互作用存在一定差異，目前對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路和端錨聚合酶在小細(xì)胞肺癌治療方面應(yīng)用的研究尚處于初步階段，需要進(jìn)一步研究。

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